3.3. Генетическое улучшение гигантской устрицы

Получение гетерозисных личинок гигантской устрицы в
питомнике ИнБЮМ НАН Украины.
В настоящее время вид C. gigas состоит из множества
популяций, географически разобщенных и не скрещивающихся
между собой. В результате продолжительного естественного отбора
в каждой популяции остаются генотипы, наиболее приспособленные
к местным условиям, поскольку концентрация аллелей в популяции,
ответственных за приспособленность, повышается с каждым
поколением и соответственно снижается норма реакции генотипов
на изменяющиеся условия существования. В каждой популяции
также сохраняется высокий уровень гетерозиготности, как результат
свободного скрещивания. При искусственном разведении устриц в
питомнике маточное стадо - это небольшое количество
индивидуумов, по сравнению с числом особей вида. В данном
случае некоторые генетические варианты или вовсе отсутствуют,
или присутствуют с нетипичной для вида частотой. Пополнение
маточного стада особями, отобранными из природных популяций,
позволяет избегать близкородственных скрещиваний, поскольку
инбридинг может быть направлен против продуктивности. Однако
сознательное применение инбридинга при выведении чистых линий
является общим приемом селекции для улучшения пород. Высокая
295
плодовитость гигантской устрицы позволяет получать необходимое
количество потомков при инбридинге.
Значительное преимущество потомков в росте и выживаемости,
по сравнению с родителями, называется гетерозисом, а гетерозис
возникает у гибридов, у которых родители имеют генотипические
различия. Гибридные потомки являются гетерозиготными по
большинству генов. Одна из характерных особенностей гетерозиса –
наиболее сильное его проявление у гибридов первого поколения.
В питомнике ИнБЮМ для получения гетерозисных потомков в
качестве производителей были использованы генетически
дифференцированные устрицы: атлантической и черноморской
когорты. Атлантическая когорта устриц была получена при
скрещивании маточного стада питомника и устриц, отобранных из
природных поселений по критерию формы и внешнего вида
раковин. Черноморская когорта инбредных устриц была получена в
результате многолетнего искусственного отбора и
близкородственных скрещиваний в течение пяти лет. Коэффициент
инбридинга, определенный согласно графику (Дубинин, 1985)
составил не менее 0,8. Угнетающее действие инбридинга
проявилось в снижении выживаемости на личиночных стадиях,
особенно на стадии раннего велигера, а также в период перехода
великонхи на стадию педивелигера. Отмечено аномальное развитие
личинок в период формирования раковины (стадия D – велигера).
Положительным эффектом при близкородственных скрещиваниях
был факт выщепления летальных генотипов. Поскольку отход
инбредных устриц, в основном, происходил на личиночных стадиях,
то слабо приспособленные особи не вовлекались в последующие
скрещивания. По результатам выживаемости личинок, полученных
в 2003 и 2006 гг. (соответственно 25 и 21,4%) можно судить о том,
что инбредный минимум достигнут, и дальнейшее снижение
выживаемости в последующих инбредных поколениях происходить
не будет. После оседания на субстрат и подращивания до товарного
размера, темп роста и выживаемость инбредной линии гигантских
устриц не отличались от таковых из естественных мест обитания.
Содержание производителей и проведение скрещиваний.
В 1998 г. из Карадагского отделения ИнБЮМ были переданы 25
экз. трехлетних C. gigas в качестве производителей, которые были

примерно 10-ым поколением устриц, акклиматизированных в
Чёрном море. В 1999 г. в питомнике института (г. Севастополь) в
результате группового скрещивания (10♀♀ × 1♂) получено
потомство гигантской устрицы. Ежегодно, начиная с 2000 по 2003
гг., личинок получали от скрещиваний потомков одних родителей
(сибсов) и (или) при возвратных скрещиваниях (родителей с
потомками). В качестве маточного стада использовали до 100 экз.
устриц, а для скрещивания отбирали около 50 экз. возраста от 1 до 4
лет.
В марте 2004 г. из питомника SATMAR (Франция) был получен
спат C. gigas высотой раковины около 15 мм. До половозрелости его
доращивали в выростном садке на мидийно-устричной ферме в
бухте Карантинная (г. Севастополь).
В 2006 г. были проведены три типа скрещиваний: № 1 - между
устрицами черноморской когорты (инбридинг); № 2 - между
устрицами атлантической когорты (аутбридинг) и № 3 -
перекрестное скрещивание, проведенное по схеме:
♀♀ черноморская когорта × ♂♂ атлантическая когорта;
♀♀ атлантическая когорта × ♂♂ черноморская когорта.
Кондиционирование производителей, стимуляцию их нереста и
весь процесс выращивания личинок осуществляли согласно патенту
№ 76680 UA. Нерест каждого производителя проходил в отдельном
сосуде с профильтрованной морской водой и аэрацией. Для
скрещивания отбирали одинаковое количество яйцеклеток от
каждой самки и сперматозоидов – от самцов. Личинок от
скрещиваний № 1 и № 2 в течение двух суток от момента
оплодотворения выращивали при плотности 50 тыс. лич./л; на
стадии велигера – при 10 тыс. лич./л; на стадиях великонхи-
педивелигера – 5 тыс.лич./л. В скрещивании № 3 плотность посадки
личинок на стадии велигера составила 30 тыс.лич./л, а на стадиях
великонхи-педивелигера – 15 тыс.лич./л.
Индекс формы раковины производителей рассчитывали по
формуле:




IF=(H+ t )/L          (1)


297
где H – высота, мм; t - толщина, мм; L – длина, мм раковины устриц.
Метрические характеристики устриц определяли штангенциркулем
(до 0,1 мм).
Коэффициент вариации размеров личинок определяли согласно
формуле:


CV=(σ/x) ×100% (2)

У черноморской когорты устриц раковина более плоская, чем у
атлантической (рис. 90).

Рис. 90. Черноморская (первый ряд) и атлантическая (второй ряд) когорты
гигантской устрицы.
Об этом можно судить как по индексу формы, так и по
показателю отношения высоты к толщине раковины. Так, у 73%
черноморских производителей высота раковины больше толщины в
3-4,2 раза. Примерно такая же доля атлантических устриц, у
которых высота раковины больше толщины в 1,41-3 раза.
Сравнение темпа роста и развития гибридных личинок с
личинками от других скрещиваний.
Личинки, полученные при скрещивании черноморской когорты
инбредных устриц с атлантической, по темпу роста и особенно
298
выживаемости на личиночных стадиях, значительно превосходили
личинок от скрещивания атлантических или черноморских.
Продолжительность выращивания личинок, от момента
оплодотворения до оседания на субстрат, в скрещиваниях
черноморских (№ 1) и атлантических устриц (№ 2) составила 25
суток, а в перекрестном скрещивании (№ 3) - 21 сутки.
Среднесуточный прирост гибридных личинок за период
выращивания в 1,2 раза превышал прирост личинок от двух других
скрещиваний и составил 13 мкм/сут. На стадии велигера (возраст 2 –
10 сут.) темп роста личинок во всех скрещиваниях был
аналогичным. На стадиях поздней великонхи и педивелигера
гибридные личинки превосходили в росте на 4,7 мкм/сут. не только
инбредных, но и личинок от скрещивания № 2. В этот же период во
всех скрещиваниях было отмечено максимальное варьирование
размеров личинок. Так, коэффициент вариации гибридных личинок
составил 11,5%; в скрещиваниях № 1 и № 2 - соответственно в 2,2 и
1,5 раза выше.
На протяжении всего периода выращивания выживаемость
гибридных личинок была максимальной. Если в скрещиваниях № 1
и № 2 максимальный отход (30 и 16,6% соответственно) отмечали в
течение 7 суток от момента оплодотворения, а на 14 сутки
культивирования в инбредном скрещивании осталось 52,6%; в
аутбредном – 72,6%, то в скрещивании № 3 насчитывалось 93,8%
личинок от исходного количества. Через три недели доля личинок в
скрещиваниях № 1 и № 2 составила соответственно 32,3%, и 56,3%,
а в третьем скрещивании - 86,4%. В этот период все гибридные
личинки были готовы к оседанию. В двух других скрещиваниях до
оседания личинок доращивали еще 4 суток.
Описанный способ получения гетерозисных личинок
гигантской устрицы C.gigas в питомнике отличается
эффективностью и превосходит таковую от других скрещиваний в
6,7 - 8,2 раз. Эффективность в данном случае – это суммарное
значение показателей превосходства гетерозисных личинок по
скорости роста (в 1,2 раза), выживаемости (в 2,5 и 4 раза) при
плотности посадки личинок в три раза превышающей оптимальные
значения, при которых выращивали личинок от других
скрещиваний.
299
Способы получения полиплоидов.
Искусственно вызванная триплоидия – это один из генетических
методов, направленных на повышение продукционных показателей
устриц. В ядре соматических клеток триплоидных моллюсков
имеется три набора хромосом (3n = 30 хр.). По причине
несбалансированности набора хромосом формирование половых
клеток не возможно и потребляемая энергия идет на соматический
рост. Линейный и весовой рост триплоидных устриц превышает
рост диплоидных (2n = 20 хр.) на 40 – 50 %. Поскольку триплоидные
устрицы не дают потомства, их необходимо каждый раз
производить в питомнике. Известно несколько способов получения
триплоидных устриц:
•
скрещивание диплоидных с тетраплоидными;
•
ингибирование (торможение) первого мейотического
деления: химическим (раствором цитохалазина B) или
физическим способами (высоким давлением; при
температуре воды, выше или ниже оптимального
значения для оплодотворения).
Тетраплоидные устрицы можно получить при блокировании
первого митотического деления оплодотворенных яйцеклеток одним
из выше указанных способов (рис.91).
Рис. 91. Схема получения тетраплоидов.

Линейный рост тетраплоидных устриц может быть несколько
ниже, чем диплоидных, но они могут и не отличаться по темпу
роста. По форме раковины тетраплоидные устрицы не отличаются
от диплоидных.
Напротив, у триплоидных устриц левая створка более выпуклая,
чем у диплоидных. Она напоминает форму лодочки. Однако, точное
определение плоидности возможно только цитокариологическими
методами. Для сохранения производителей живыми, целесообразно
оценивать плоидность по их половым клеткам.
Получение тетраплоидов воздействием на оплодотворенные
яйцеклетки водой аномальной температуры.
Оплодотворенные яйцеклетки переносили в морскую воду и
выдерживали при температуре 4оС (или 35оС) в течение 15 мин.
Затем возвращали в воду 25оС. Количество тетраплоидов составило
46 - 60 %. Выживаемость полиплоидных личинок возрастает, при
воздействии водой низкой температуры (рис. 92).

Рис. 92. Диплоиды (2n = 20 хромосом): а – метафаза митоза; б - анафаза митоза
и тетраплоиды (4n = 40 хромосом): в - метафаза митоза; г - анафаза митоза
гигантской устрицы, полученные в питомнике ИнБЮМ методом температурного
шока (х 1575).

Получение тетраплоидов при воздействии высоким давлением.
В прибор, создающий давление 8 атм., помещали открытую
пластмассовую пробирку с оплодотворенными яйцеклетками.
Плотность посадки яйцеклеток - 50 тыс./л, продолжительность
воздействия - 15 мин. Выход полиплоидов - до 60% .
Получение триплоидов обработкой оплодотворенных
яйцеклеток раствором цитохалазина В (СВ) (рис. 93).

Рис. 93. Схема получения триплоидов и гиногенетических диплоидов.
Через 5 – 7 мин. после оплодотворения при температуре воды
20°С яйцеклетки переносили в 1 М раствор цитохалазина В (0,5
мг/л). Объем емкости – 500 мл; плотность посадки яйцеклеток -
5·106 яиц/л. Продолжительность воздействия – 15 мин. Затем
яйцеклетки промывали в течение 15 мин. в фильтрованной морской
воде и переносили в емкость с фильтрованной морской водой и
аэрацией. Эмбриональное развитие проходило при плотности
посадки 50 000 яиц/л. При таком способе выход полиплоидов
составил от 38 до 68%.
Получение гиногенетических диплоидов.
В случае необходимости сохранения и передачи потомкам
только материнского генома, оплодотворение проводят
инактивированной радиацией спермой и воздействием на
оплодотворенные яйцеклетки цитохалазином В в период второго
302
мейотического деления (на 40 мин. после оплодотворения).
Продолжительность воздействия прежняя (см. рис. 93).