6.6. Повышение качества выпускаемой молоди шемаи путем применения пробиотической добавки Bacillus subtilis ВКПМ В-1895
Конечная цель развития аквакультуры – улучшение здоровья
и продление активного периода жизни населения России. Увеличение
доли продукции из рыбы и гидробионтов в питании человека
действительно имеет благотворные последствия. Однако в современных
технологиях аквакультуры есть элемент, способный привести к обратному
эффекту. В стартовых и продукционных кормах широко применяются антибиотики. Их использование ведет к накоплению в окружающей
среде микроорганизмов с комплексной антибиотикоустойчивостью.
Генетические детерминанты антибиотикоустойчивости, попадая
в геномы патогенных видов, делают вызываемые ими инфекционные
заболевания практически неизлечимыми. Поэтому, в частности,
смертность от туберкулеза в последнее время приблизилась
к показателям начала ХХ столетия. В отличие от сельскохозяйственных
технологий, при использовании антибиотиков в аквакультуре
предотвратить их попадание в природные водоемы практически
невозможно. Последнее определяет актуальность внедрения
альтернативных методов профилактики заболеваний водных объектов.
Наиболее перспективны в этом плане пробиотические препараты,
представляющие собой сухие культуры жизнеспособных бактерий-
симбионтов. Они оказывают свое благотворное действие на организм.
Комплексное использование пробиотиков дает возможность более
результативно стабилизировать микрофлору кишечника, обмен веществ
и укрепить иммунитет рыб.
В связи с этим в АзНИИРХ был разработан пробиотический
препарат на основе Bacillus subtilis B-1895.
Апробация препарата осуществлялась в условиях типового
карпового хозяйства во время воспроизводственных работ
с Краснокнижным видом азовской фауны – шемаей.
Использование высоких плотностей посадки, экономящих прудовые
фонды и материальные средства рыбоводных хозяйств, приводит
к возникновению проблем при выращивании молоди – снижаются
рыбопродуктивность и рыбоводные качества выпускаемой молоди
(снижается масса рыб, появляются болезни). В связи с этим появилась
необходимость исследований влияния пробиотического препарата
в указанных воспроизводственных работах.
Прудовые исследования проводились в двух выростных прудах одного из рыбоводных хозяйств Нижнего Дона площадью по 0,2 га каждый. Для стимулирования развития естественной кормовой базы в прудах применялись следующие мероприятия:
– перед заполнением опытных прудов водой проводилось провокационное залитие с целью уменьшения развития и влияния на гидробиологические процессы лептестерии, стрептоцефаллюса и щитня;
– после провокационного залития пруды спускали, хлорировали и вносили минеральные и органические удобрения по сухому ложу;
– в середине июня вместе с повторным внесением навоза по прибрежной зоне вносили культуру Daphnia magna (1 кг/пруд), а в конце июня, также с навозом, – культуру Ceriodaphnia sp. (0,5 кг/пруд);
– скашивали высшую водную растительность и вносили ее в пруды в подвяленном виде в качестве зеленых удобрений.
Плотность зарыбления личинками при выращивании в опыте и контроле была близкой (табл. 64). Длительность выращивания составила в опыте 75, в контроле – 77 суток.
Поскольку шемая является пелагической рыбой с верхним ртом, она на стадии малька начинает использовать в пищу, наряду с планктонным кормом, насекомых, падающих на поверхность воды, а также плавающие фракции искусственного корма (шрот и мучку различных злаковых культур). В опыте пробиотический препарат вводили в состав искусственного корма в количестве 0,1 % к массе корма.
Кормление искусственным кормом осуществлялось с 25 суток от момента вселения личинок из расчета 15 % от биомассы молоди в пруду. Пробиотический препарат добавляли в корм в опытном пруду с 42 по 75 сутки. Использовали рыбный карповый комбикорм мелкой фракции, содержащий 23 % протеина. Кормление осуществляли два раза в сутки. Опытная партия рыбы получала пробиотический препарат вместе с рассыпным карповым кормом в течение месяца.
64 Основные характеристики прудов, перечень интенсификационных мероприятий и рыбоводные данные
Показатели
Пруды
контрольный опытный
Площадь пруда, м2 2000 2000
Глубина, м 0,8 0,8
Количество вселенных личинок, тыс. шт.
310 312
Плотность посадки, тыс.шт./га шт./м3
1550 194
1560 195
Индивидуальная масса личинок, мг 1,8 1,8
Выкос растительности, даты 27.06, 11.07 28.06, 12.07
Внесение навоза, т/га 0,625 0,625
Внесение аммиачной селитры, дата кг/га
29.05 165
29.05 165
Интродукция дафнии, дата 14.06 14.06
Интродукция цериодафнии, дата 28.06 28.06
Среда обитания выращиваемой шемаи по гидрохимическим
показателям не выходила за рамки нормативных величин благодаря
своевременной подаче свежей воды, выкосу высшей растительности
и удалению из водоемов погруженной растительности.
В зоопланктоне опытных прудов обнаружено 31 таксонов рангом
ниже рода, из Rotatoria, Сopepoda, Сladocera, Gastropoda, Euphillopoda,
Entomostraca, Insecta larva, Nematoda.
В зоопланктоне контрольного пруда обнаружено 22 вида
гидробионтов. Наиболее многочисленными были кладоцеры,
представленные 7 видами и хирономиды – 4. Средняя численность
и биомасса зоопланктона составляли 760,4 тыс. экз./м3 и 34,38 г/м3,
соответственно. В период вегетации общая биомасса зоопланктона
изменялась от 2,2 до 80,55 г/м3. Во время вселения личинок шемаи
в зоопланктоне развивались кормовые, морфологически доступные
формы зоопланктона – коловратки, молодь копепод и кладоцер.
В первой половине июня в остаточном зоопланктоне преобладали
кладоцеры мелких размеров, такие как Ceriodaphnia reticulatа,
Moina micrura и молодь копепод. Конец июня и первая половина
июля характеризовались снижением биомассы кормовых организмов
зоопланктона до 0,54 г/м3. Затем до конца выращивания в кормовом
зоопланктоне данного пруда доминировали кладоцеры, биомасса
которых достигала в третьей декаде июля 80,55 г/м3 за счет развития
дафнии и цериодафнии.
В зоопланктоне опытного пруда отмечено также 22 вида
гидробионтов. В период посадки (третья декада мая) в нем развивались
коловратки, молодь копепод и кладоцер. В первой декаде июня
доля мелких форм зоопланктона в биомассе была очень высокой,
составляя 98,1 % от общей биомассы в 148,1 г/м3. Во второй и третьей
декадах июня наблюдался спад в развитии зоопланктона в результате
интенсивного развития лептестерии, оказавшей негативное
воздействие на развитие кормового зоопланктона. После окончания
цикла развития лептестерии (конец июня) получили развитие кладоцеры
(Daphnia sp., Scapholeberis mucronata, Diaphanosoma brachiurum,
Ceriodaphnia reticulatа) со средней за июль биомассой 32,1 г/м3, в августе
также продолжали доминировать кладоцеры (Diaphanosoma brachiurum,
Daphnia sp.).
Степень развития прудового зоопланктона, используемого молодью
шемаи в качестве пищи, представлена в таблице 65.
Таблица 65 Среднесезонные значения численности и биомассы групп зоопланктона
Группы организмов
Контроль Опыт численность* биомасса
%
численность биомасса
%
Коловратки
Ветвистоусые рачки
Веслоногие рачки
Личинки комаров
2,6 0,08
631,9 17,61
124,2 2,66
1,68 4,03
0,3 0,2
80,7 47,5
15,9 7,2
0,2 10,9
15,93 0,04
361,8 26,38
88,29 1,67
0,9 0,02
3,3 0,1
75,6 82,4
18,4 5,2
0,0 0,3
Итого кормовых
760,38 34,38
97,1 65.8
466,92 28,11
97,3 88,0
Личинки поденок
Остракоды
Прочие
12,6 9,93
6,58 1,89
0,4 2,3
1,6 26,8
0,8 5,1
0,4 2,3
0,08 0,1
8,25 0,05
0,6 3,76
0,9 11,3
1,7 0,2
0,0 0,5
Итого
783,1 37,06
100,0 100,0
478,8 32,02
100,0 100,0
Примечание: в числителе – численность, тыс. экз./м3; в знаменателе – биомасса, г/м3.
Показатели остаточной биомассы и численности организмов
и преобладание ветвистоусых рачков говорит о высокой кормности
прудов (Шмакова и др., 2001).
Массовое развитие гидробионтов было обусловлено проведением агромелиоративных мероприятий при подготовке водоемов, внесением минеральных и органических удобрений в течение всего периода
выращивания, а также интродукцией Daphnia sp. и Ceriodaphnia reticulatа.
В обоих прудах кормовые условия были благоприятными: в мае,
во время вселения личинок рыб, отмечено интенсивное развитие коловраточного корма и науплиальных стадий копепод, потребляемых
личинками на ранних стадиях развития. В июне коловраток сменили ветвистоусые рачки и продолжали развиваться веслоногие, ставшие
по размеру доступными для подросшей молоди. Средняя биомасса зоопланктона обоих прудов имела высокие значения и на 65,8–88,0 %
состояла из кормовых, морфологически доступных гидробионтов для выращиваемых особей. Несмотря на обилие естественного корма,
молодь потребляла искусственный корм с поверхности водного зеркала.
Как показывают исследования, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis выделяют в кишечнике биологически активные вещества,
продуцируют различные пищеварительные ферменты. В результате улучшается пищеварение, повышается усвоение кормов, увеличиваются
среднесуточные привесы, стимулируется рост животных, птицы, рыб. Исследования возможностей применения пробиотика Субтилис
на ранних стадиях выращивания рыб, показали, что обработка пробиотиком икры, эмбрионов и личинок увеличивает коэффициент
выживаемости и снижает естественную смертность рыб на личиночной стадии развития, способствует стимуляции жизнестойкости рыб
на ранних этапах онтогенеза и естественного иммунитета (Шульга, 2006). Наши исследования подтверждают эти выводы.
Основной характеристикой роста молоди шемаи в вегетационный период является изменение индивидуальной массы подращиваемой молоди в динамике. Темп роста в опыте в начальный период
подращивания отставал от контроля. По истечении двух недель от начала использования пробиотического препарата в составе искусственного корма нарастание массы тела в опыте стало увеличиваться и превысило к моменту выпуска значения
в контроле (рис. 59).
Рисунок 59 – Динамика накопления массы молодью шемаи при выращивании: 25 сутки – начало кормления искусственным кормом, 42 сутки – начало кормления с пробиотической добавкой в опыте
К концу подращивания средняя масса молоди в опыте превышала контроль на 36,5 %, составив 288 мг против 211 мг в контроле.
При одинаковой плотности зарыбления личинок в пруды, высокой обеспеченности молоди естественным кормом, выживаемость в контрольном и опытном прудах имела близкие значения. Использование пробиотической добавки в составе искусственного корма определило более интенсивный рост молоди в опытном пруду по сравнению с контрольным. Коэффициент упитанности молоди в опыте превышал контрольные значения (1,3±0,10 и 1,2±0,06, соответственно), ежесуточный прирост массы тела молоди шемаи в опыте составил 3,8, в контроле – 2,7 мг, а рыбопродуктивность в опыте на 36,2 % превышала контрольный вариант (табл. 66).
По литературным данным (Панасенко, 2006) пробиотик «Субтилис» предназначен для резкого повышения рыбопродуктивности на 20 %. В наших экспериментах использование пробиотика на основе штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-1895 (Чистяков и др., 2007) привело к повышению рыбопродуктивности на 36,2 % по сравнению с контролем (табл. 66).
Критерий достоверности Стьюдента, рассчитанный для массы молоди опытного и контрольного прудов, составил 7,6, что говорит о высокой достоверности различий.
До начала эксперимента и после его окончания был исследован состав микрофлоры поверхностных тканей и кишечника исследуемой рыбы.
Таблица 66 Рыбоводные результаты выращивания молоди шемаи
Показатели
Пруды контрольный опытный
Сравнение опыта с контролем Кол-во вселенных личинок, тыс. шт. ± 310 ± 312 =
Плотность посадки, тыс. шт./га шт./м3
± 1550 ± 194
± 1560 ± 195
= =
Индивидуальная масса личинок, мг 1,8 1,8 =
Коэффициент упитанности по Фультону 1,2 ± 0,06 1,3 ± 0,10 >
Ежесуточный прирост молоди, мг 2,7 3,8 > на 40,1 %
Выживаемость молоди, тыс. шт. % от посадки
153,3 49,5
153 49,0
? ?
Рыбопродуктивность, кг/га 161,7 220,3 > на 36,2 %
Средняя масса выпускаемой молоди, г 0,211 ±5,8 0,288± 8,4 > на 36,5 %
До начала кормления шемаи пробиотическим препаратом присутствие
во всех исследованных образцах поверхностных тканей и кишечника
шемаи бактерий, относящихся к роду Alcaligenes, подтверждает
тот факт, что больше всего в рыбе содержится бактерий семейства
Achromobacteriaceae. С большой частотой в указанных образцах также
обнаруживали представителей семейства Enterobacteriaceae, бактерий
родов Pseudomonas, Micrococcus.
По данным бразильских исследователей (Faber de Freitas et al., 1985),
изучавших обсемененность поверхностных и внутренних тканей речных
и озерных рыб, обнаруживались в большом числе представители
естественной микрофлоры рыб – бактерии родов Aeromonas, Acinetobacter,
Pseudomonas, Micrococcus. Тот факт, что в желудочно-кишечном
тракте рыб обычно обитают представители тех же родов, которые
обсеменяют покровные ткани и наружные жабры рыб и микрофлора
кишечника рыб зависима от окружающей среды, подтверждают данные
Шевана (1961, 1962).
Особый интерес имело определение патогенной микрофлоры
рыбы, выращиваемой в условиях прудового хозяйства. По данным Мюнх
с соавторами(1985), с большой частотой в образцах рыбы обнаруживали
представителей семейства Enterobacteriaceae. Edwardsiella и Salmonella
определяли в среднем в 65 % проб, что является свидетельством
плохого санитарного состояния водоемов, загрязнения прибрежных зон
в результате поступления неочищенных сточных вод.
Полученные нами данные свидетельствуют о присутствии в образцах шемаи штамма Klebsiella sp., что говорит о неблагополучном санитарном состоянии. Как известно, из энтеробактерий особую опасность представляют микроорганизмы родов Сitrobacter, Klebsiella, Enterobacter и Proteus. У больных рыб наблюдается поверхностный дерматонекроз, геморрагии, отек внутренних органов, тимпания и т.д. У человека бактерии рода Klebsiella часто вызывают оппортунистические инфекции, в том числе бактериемию, пневмонию, инфекции мочевых
путей.
С помощью ПЦР все пробы тканей рыб были исследованы
на присутствие ДНК Yersinia enterocolitica, Candida albicans,
Salmonella sp. и L. monocytogenes.
Выделение ДНК из проб рыбы, постановка полимеразной цепной
реакции и анализ продуктов амплификации посредством электрофореза
в 1,5%-ном агарозном геле позволили зарегистрировать ДНК
Salmonella. Визуализация ПЦР-продуктов показала присутствие
в пробе No 12 из кишечника шемаи ДНК Salmonella. Выделение
из рыбы патогенных для человека микроорганизмов имеет особое
значение. Последние чаще загрязняют внутренние водные бассейны
и прибрежные зоны в результате поступления неочищенных
сточных вод.
Таким путем в водоемы могут поступать и, следовательно,
обнаруживаться представители группы кишечных палочек (в том числе
и энтеропатогенные серотипы), энтерорококки, Salmonella, Schigella,
S. auгеus, Listeria monocytogenes, Candida albicans.
Источником инфицирования сальмонеллой воды и рыбы могут
являться животные и птицы, кормящиеся этой рыбой. Сальмонеллы
могут длительно сохранять жизнеспособность во внешней среде.
Так, в воде открытых водоемов они могут жить до 120 дней,
в морской воде – до 217 дней. Возбудители болезни-бактерии
рода сальмонелл, мирно проживают в организмах животных, рыб и птиц.
Попадая в организм человека в основном через пищу (мясо животных
и птицы, яйца, рыба) или питье (сырая вода и молоко), сальмонеллы
внедряются и начинают жить в стенках человеческого кишечника.
Исследование микрофлоры шемаи по истечении срока, во время
которого они получали пробиотик, показало, что основной состав
нормальной микрофлоры шемаи остался неизменным. Тем не менее,
введение пробиотического препарата способствовало исчезновению из состава микрофлоры шемаи штаммов Salmonella и Klebsiella –
потенциальных возбудителей инфекционных заболеваний.
Таким образом, использование пробиотической добавки на основе Bacillus subtilis B-1895, удобной в хранении, транспортировке,
применении, с высокой биологической усвояемостью за счет
сохранения живых компонентов корма в активном состоянии, позволяет:
– оставаться неизменным основному составу нормальной
микрофлоры молоди рыб;
– исчезнуть из состава микрофлоры молоди рыб штаммов Salmonella и Klebsiella – потенциальных возбудителей инфекционных
заболеваний.
– добиваться увеличения массы тела выращиваемых рыб на 36,5 %;
– увеличить рыбопродуктивность на 36,2 %.
На основе проведенных исследований был получен патент РФ (Пат. 2376755 Российская Федерация, МПК7 А 01 К 61/00.
Способ подращивания молоди азово-черноморской шемаи в прудах
/ Карпенко Г.И. и др.; заявитель и патентообладатель Азовский. науч.-ислед. ин-т рыбного хозяйства. – No 2008130542/09; заявл. 23.07.08;
опубл. 27.12.09, Бюл. No 36 – 3).
