2.2. Маточные растворы

2.2.1. Общие комментарии

Среда в основном состоит из трех компонентов: макроэлементов, микроэлементов и витаминов, которые готовят как маточные растворы в количестве 100мл на 1л при концентрации питательных веществ, превы- шающей необходимую дозу в конечном растворе в 100 или 1000 раз. Для получения среды берут небольшое количество маточного раствора, напри- мер, всего 1мл. Использование маточных растворов дает целый ряд пре- имуществ:

- позволяет избежать ошибок при взвешивании маленьких коли- честв солей;

- однажды приготовив маточный раствор, можно многократно легко готовить питательную среду. Теоретически, если приготовить 1л маточно- го раствора и использовать 1 мл этого раствора для приготовления 1л пи- тательной среды, то можно приготовить 1000л среды.

Методика приготовления маточных растворов заключается в сле- дующем:

– добавить приблизительно 80-90% необходимого объема дистилли- рованной или деионизированной воды в мензурку;

– растворить необходимое количество взвешенного вещества при по- стоянном перемешивании. Если маточный раствор включает несколько компонентов (например, растворы микроэлементов), необходимо сначала полностью растворить первый компонент, и только после этого добавить следующий. Большинство компонентов среды легко растворяется при перемешивании, однако для быстрого растворения некоторых веществ необ- ходимо нагревание или изменение рН среды;

– разбавить полученный раствор дистиллированной или деионизиро- ванной водой до необходимого объема.

Маточные растворы необходимо хранить в холодильнике при темпе- ратуре +4 ?С в плотно закрытой стеклянной или пластиковой посуде для предотвращения изменения первоначальной концентрации в результате испарения.

Маточные растворы, содержащие субстраты, которые способствуют росту бактерий и грибов, должны быть подвергнуты стерилизации. Если маточные растворы имеют видимые признаки грибного или бактериально- го загрязнения, они должны быть приготовлены заново. Необходимо пре- дохранять растворы от испарения воды. При испарении воды концентра- ция раствора может увеличиваться до неизвестных значений. Если необхо- димо провести точные эксперименты, лучше всего использовать свежие маточные растворы макро- и микроэлементов. Ниже приводятся практиче- ские протоколы для приготовления растворов макроэлементов, микроэле- ментов и витаминов (Watanabe, 2005).

2.2.2. Макроэлементы

Маточные растворы макроэлементов необходимо готовить по от- дельности в виде сильно концентрированных растворов (см. 2.2.1.). Рас- творы фосфатов нельзя хранить в полиэтиленовых емкостях, так как фос- фат ионы хорошо адсорбируются полиэтиленом (Hassenteufel et al., 1963). Растворы силикатов не следует хранить в стеклянной посуде, так как стек- ло может переходить в раствор. Для этих целей лучше использовать теф- лоновую, полиэтиленовую или поликарбонатную посуду. Если необходимо провести эксперимент без силикатов, маточные растворы следует хра- нить в стеклянной посуде.

2.2.3. Микроэлементы

Растворы микроэлементов обычно готовят в виде отдельных раство- ров или смешанных растворов. В некоторых случаях они добавляются не- посредственно в раствор в концентрациях от 0,1мг до 20мг на литр. Во многих, натриевая но этилендиаминтетрауксусная не во всех средах для пресноводных кислота) водорослей используется Na

2

EDTA в (ди- качестве хелатора. Когда используется EDTA, ее следует добавлять сразу же после добавления металлов. Практические рекомендации по последовательности приготовления растворов приводятся ниже (Watanabe, 2005).

2.2.3.1. Приготовление отдельных растворов

Отдельные (например, содержащие соли одного металла) растворы готовятся в концентрации, в 1000 раз превышающую концентрацию в ко- нечном растворе. Рецепты маточных растворов для приготовления пита- тельных сред приводятся в Приложении 1. Схема приготовления маточных растворов включает в себя два этапа:

– в дистиллированную или деионизированную воду (объемом при- мерно 800-950мл) добавляют необходимое количество микроэлементов. В случае растворения железа, кобальта, меди, марганца и цинка можно про- кипятить раствор в течение 5-10 минут для ускорения процесса;

– раствор доводят до конечного объема (1л) путем добавления дис- тиллированной или деионизированной воды.

Растворы солей хранят в холодильнике при +4 ?С в пластиковой, плотно закрытой емкости для предотвращения испарения.

Когда необходимо приготовить раствор микроэлементов небольшой концентрации, необходимо приготовить маточный раствор, очень точно взвешивая соль. Затем нужно разбавить раствор до получения необходи- мой концентрации (Watanabe, 2005).

2.2.3.2. Смешанный маточный раствор (рабочий маточный раствор)

При приготовлении смешанного маточного раствора следует соблю- дать следующую последовательность операций:

– в мензурку наливают приблизительно 80% необходимого объема дистиллированной или деионизированной воды (например, 800мл на 1 л раствора); – если в качестве хелатора используется тор, в первую очередь растворяют его;

Na2

EDTA или другой хела-

24

– добавляют необходимый объем каждого микроэлемента из от- дельного раствора, каждый раз хорошо перемешивая смешанный ма- точный раствор;

– доводят объем раствора до нужной величины дистиллированной или деионизированной водой и хранят его в холодильнике.

Для удобства лучше перелить маточные растворы в емкости ма- ленького объема. Например, если для приготовления конечного раство- ра требуется 1мл маточного раствора, 1мл раствора можно поместить в эппендорф и заморозить, или же разлить раствор в склянки по 10мл (Watanabe, 2005).

2.2.4. Витамины

Для культивирования водорослей обычно используют три витамина – витамин B

1

(тиамин), витамин B

12

(цианокобаламин) и витамин H (биотин). Многие водоросли нуждаются только в одном или двух из этих витаминов, но внесение витаминов, в которых водоросли не нуждаются, не может причинить им никакого вреда (Provasoli, Carlucci, 1974). Кроме этих трех витаминов, в ре- цептах некоторых сред упоминаются и другие витамины. Например, для при- готовления среды для культивирования Phacotus lenticularis (Ehrenberg) Stein необходимо добавление никотинамида (Schlegel et al., 2000).

Витамины подвергаются многократному автоклавированию вместе с конечной средой. Несомненно, это приводит к их разрушению, но даже в этом случае они сохраняют свою эффективность. Лучше всего добавлять асептические растворы витаминов в среду после автоклавирования.

2.2.4.1. Приготовление отдельных растворов витаминов

Для биотина и цианокабаламина необходимо готовить отдельные маточные растворы, и для удобства, особенно если требуется приготовить несколько сред с различным содержанием витаминов, необходимо приго- товить первоначальный раствор тиамин?HCl. Концентрация маточного раствора должна превышать концентрацию конечного раствора в 100 - 10000 раз. Точные концентрации зависят от того, какое количество вита- мина должно содержаться в среде.

Маточные растворы витаминов должны быть стерилизованы с ис- пользованием фильтров и помещены в емкости маленького объема (на- пример, 1-10мл эппендорфы или пробирки из поликарбоната) с соблюде- ние условий стерильности. В качестве альтернативы можно предложить следующий способ: первоначальный раствор может быть помещен в ма- ленькие пробирки и затем автоклавирован как окисленный раствор (рН=4,5-5), но при этом следует помнить, что некоторые пластмассы тают в автоклаве, а стеклянные пробирки могут разбиться при замораживании (Watanabe, 2005).

2.2.4.2. Смешанный маточный раствор витаминов

Для приготовления смешанного раствора, который обычно содержит все витамины, необходимо растворить аликвоту (обычно 1мл) каждого от- дельного маточного раствора в 100 или 1000мл дистиллированной или деионизированной воды. Конечный объем смешанного раствора может различаться в зависимости от необходимой концентрации того или иного витамина в растворе. Смешанный маточный раствор стерилизуется и по- мещается в маленькие емкости так, как было описано выше. Этот раствор лучше хранить в замороженном виде (Watanabe, 2005).