2.3. Общие методы приготовления питательных сред

Питательные среды для культивирования водорослей можно разде- лить на три группы: синтетические, обогащенные и почвенные вытяжки. Синтетические (искусственные) среды были созданы прежде всего для то- го, чтобы обеспечить культивирование водорослей как для эксперимен- тальных исследований, так и для поддержания жизнеспособности штам- мов. В качестве примеров можно привести среды Болда, Чу-10, BG-11, WC (см. Приложение 1). Эти среды могут быть как жидкими, так и агаризован- ными. При использовании питательных сред следует помнить, что дистил- лированная и деионизированная вода, а также ультрачистые химикаты мо- гут содержать следовые количества посторонних примесей, измеряемых нанограммами или пикограммами.

Обогащенные среды готовятся путем добавления питательных ве- ществ к естественной озерной или проточной воде или обогащением син- тетической среды раствором почвенной вытяжки, растительных экстрактов (например, торфяного мха), экстракта дрожжей и т.д. Обогащенные среды содержат неопределенные количества питательных веществ, так как озер- ная и проточная вода имеет множество органических и неорганических молекул, химический состав экстрактов тоже неизвестен. Вообще, обога- щенные среды не используются для физиологических экспериментов, од- нако водоросли часто растут на них, сохраняя нормальную морфологию. Природная вода должна быть относительно чистой и не иметь загрязнения. Если природная вода содержит значительное количество органических примесей, это может вызвать интерференцию в молекулярно- биологических исследованиях, особенно когда нуклеиновые кислоты вы- деляются без промывания клеток. В качестве примера обогащенной среды можно привести среду Algo-Gro (Carolina Biological Supply Co.), среду для выращивания Audouinella, среды для диатомовых водорослей, среду VS, модифицированную среду для Porhyridium, среду Малта, среду для Poly- toma (Andersen et al., 2005).

Почвенную вытяжку готовят добавлением 1-2см высушенной и про- сеянной садовой почвы на дно склянки с водой. Вытяжка подобна озеру или пруду, где питательные вещества постоянно циркулируют из донных отложений в верхние слои воды благодаря жизнедеятельности бактерий и перемешиванию воды. В почвенной вытяжке диффузия, также как и био- химическая активность бактерий (ксеничные культуры) и водорослей на границе почвы и воды, имитируют естественные условия. Состав почвен- ной вытяжки зависит от почвы (например, рН, питательные вещества, ор- ганические буферы, витамины), и поэтому очень важно найти хорошую и в то же время соответствующую почву. Водоросли, растущие на почвенной вытяжке, обычно имеют нормальную морфологию, и эти культуры можно поддерживать длительное время (Watanabe, 2005).

2.3.1. Синтетические среды

От качества приготовленной синтетической среды в значительной мере будет зависеть характер и интенсивность роста водорослей. Синтети- ческие среды готовят следующим образом: – добавляют приблизительно 80-90% необходимого объема воды в мензурку; – если требуется буфер, вносят необходимое количество взвешенного бу- фера (например, трис-глициглицина, HEPES, TAPS, Bicine, MES), посто- янно перемешивая раствор; – в зависимости от состава раствора добавляют необходимые питательные вещества из предварительно приготовленных маточных растворов или взвешенное количество веществ при постоянном перемешивании; – доводят раствор до необходимого объема дистиллированной водой; – при необходимости регулируют рН раствора путем добавления либо 1н. рас- твора NaCl, либо 1н. раствора NaOH (если в среде отсутствует буфер); – приготовленную среду переливают в емкость для культивирования, на- пример, по 10мл в пробирки. Далее пробирки со средой автоклавируют или стерилизуют с помощью фильтра; – после стерилизации автоклавированием среду охлаждают и дают ей от- стояться в течение 24 часов для восстановления равновесия неорганиче- ских углеродных компонентов. В случае использования колб большого объема необходимо провести аэрацию для ускорения восстановления рав- новесия (Watanabe, 2005).

2.3.2. Обогащенные среды

При приготовлении обогащенной среды добавляют приблизитель- но 80-90% от требуемого объема дистиллированной или природной воды в мензурку.

Если используется природная вода, ее необходимо взять из того источника, где ранее были отобраны пробы водорослей. После чего эту воду автоклавируют или пастеризуют. В данном случае можно использовать другой способ стерилизации – фильтрацию, при этом используют фильтры с размером пор 0,22?м. Однако следует отметить то, что эта процедура не позволяет обезвредить вирусы.

Далее в воде растворяют каждый компонент (из маточного раство- ра или взвешенное количество): макроэлементы, микроэлементы, витами- ны, экстракты или органические вещества (например, экстракт дрожжей, солода, торфяного мха или почвы). Раствор с питательными веществами доводят до необходимого объема, доливая в колбу дистиллированную или природную воду соответственно.

Важное значение для развития водорослей имеет рН среды. Большин- ство водорослей предпочитают нейтральную или слабощелочную реакцию, равную 7,0-7,6. Исключение представляют водоросли дистрофных водоемов и торфяных болот. Поэтому, по возможности, так же как и при приготовлении синтетических сред, необходимо отрегулировать рН раствора.

Затем среду переливают в емкость для культивирования, которую потом автоклавируют или стерилизуют с помощью фильтра (Watanabe, 2005).

2.3.3. Почвенная вытяжка

Далеко не все водоросли могут хорошо расти на чистых минераль- ных и обогащенных средах. Многие из них для нормального роста требуют наличия органических веществ. Из органических сред наибольшего вни- мания заслуживает почвенная вытяжка. Среды, приготовленные с ее ис- пользованием, обладают хорошей буферностью по отношению к железу и содержат микроэлементы. Но эти среды не пригодны для физиологических опытов по питанию водорослей.

Приготовление почвенной вытяжки – очень важный этап в технике культивирования водорослей. При получении почвенной вытяжки необхо- димо соблюдать ряд правил.

Слой садовой земли (высушенной и просеянной) толщиной 1-2см помещают на дно пробирки (колбы, бутылки и т.д.). Добавляют дистилли- рованную или деонизированную воду до заполнения 3?4 сосуда, закрывают колбу ватной пробкой или крышкой. В течение 1ч в последующие 2 дня емкость со средой хорошо пропаривают. Обычно почвенная вытяжка не автоклавируется, так как в этом нет необходимости. Однако для многих водорослей (но не для всех!), стерильная почвенная вытяжка является хо- рошей питательной средой. Пропаренную вытяжку охлаждают в течение 24 часов, затем хранят в холодильнике.

Почвенная вытяжка может быть модифицирована путем прибавле- ния следующих добавочных компонентов (до того, как туда будет добав- лена почва):

28

для – гих щепотки фототрофных измельченного пресноводных до порошкообразного водорослей (Starr, состояния Zeikus, 1993);

CaCO

3

мно-

– новых щепотки (Starr, NH

Zeikus, 4

MgPO

1993);

4

для Botryococcus, Synechococcus и некоторых эвгле-

– садового торфа, высушенного в течение 12ч для некоторых эвгленовых, флагеллят и других миксотрофных водорослей (Starr, Zeikus, 1993; Schlosser, 1994); – 1?2 чайной ложки органического торфа и 1?4 чайной ложки почвы для большинства ацидофильных водорослей (Starr, Zeikus, 1993).

2.3.4. Твердые питательные среды

2.3.4.1. Стандартный питательный агар

Г.Клебс (G.Klebs) и Н.Тишуткин (N.Tischutkin) были первыми исследо- вателями, которые использовали твердые агаризованные среды для культиви- рования водорослей, так как питательный агар очень хорошо подходил для выращивания большинства пресноводных водорослей. Небольшое количество суспензии клеток распределяют по поверхности агара, и обычно клетки начи- нают медленно расти на его поверхности.

Агар обычно готовят в концентрации 1-2%. На таких средах хорошо растут многие водоросли. Но на агаризованных средах водоросли растут медленнее по сравнению с жидкими средами. Обычная процедура приго- товления агаризованной среды описана ниже:

2-литровую колбу Эрленмейера с 1л среды нагревают до температу- ры 95oC в сухожаровом шкафу или на плитке, либо с помощью водяной бани. После этого в колбу медленно добавляют необходимое количество агара при постоянном перемешивании так, чтобы весь агар растворился в среде. Летом желательно агара брать больше, зимой – меньше, так как при более низкой температуре среды хорошо затвердевают.

Агаризованную среду используют в основном для выделения чистых культур, хранения музейных коллекций, а также для обрастающих форм водорослей. В практике культивирования водорослей применяют агаризо- ванные чашки Петри или агаризованные косяки.

Приготовление агаризованных чашек Петри. Сначала агар автокла- вируют при температуре 120 ?C в течение 20 минут, потом охлаждают его до 50-60 ?C, после чего разливают в стерильные чашки Петри. Нагретую среду следует держать при температуре 50-60 ?C, поместив на водяную ба- ню. Если разлить по чашкам слишком горячий агар, будет образовываться конденсат. После застывания среды чашки следует перевернуть и хранить в воздухонепроницаемом контейнере (пластиковом пакете, закрытой емко- сти) при температуре 4 ?C в холодильнике.

Приготовление агаровых косяков в пробирках. Агар наливают в про- бирки, затем стерилизуют в автоклаве так же при температуре 120 ? C в течение 20 минут. После автоклавирования пробирки помещают на поверх- ность с уклоном и охлаждают. Разные компании изготавливают специаль- ные стойки для застывания среды (Watanabe, 2005).

2.3.4.2. Питательные чашки с агаром

Некоторые водоросли не растут на поверхности агара, но они хоро- шо растут внутри него (Skinner, 1932). Для того, чтобы поместить клетки внутрь среды, готовят 1-2% агар, и когда стерильный раствор остынет до состояния геля, его перемешивают с жидкой суспензией культуры. Смесь перемешивают для равномерного распределения водорослей. Потом агар разливают в чашки Петри. Для водорослей, чувствительных к высоким температурам, можно использовать агарозу, застывающую при низкой (26±2 ?C) или при очень низкой температуре (8-17 ?C) (Shirai et al., 1989; Watanabe et al., 1998).