ГЛАВА 2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВОДОРОСЛЕЙ

ГЛАВА 2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВОДОРОСЛЕЙ

2.1. Материалы

2.1.1. Химикаты

Химические реактивы, необходимые для приготовления питатель- ных сред, должны быть самого высокого качества. Качество определяется изготовителем, и каждая фирма использует свою собственную маркировку для его обозначения. Для определения качества реактивов можно исполь- зовать каталоги компаний и информацию, размещенную на Интернет- сайтах. В последнее время установлено, что большинство солей и реаген- тов содержат следовые количества металлов и других загрязнителей, что может замедлять рост олиготрофных видов. К тому же, примеси тяжелых металлов в растворах солей могут приводить к увеличению номинальной концентрации солей в некоторых средах. В таких случаях необходима до- полнительная очистка химикатов (Watanabe, 2005).

2.1.2. Оборудование

Определенный минимум оборудования (стеклянная и пластиковая посуда, аналитические весы с точностью до 1мг, рН-метр и магнитная ме- шалка) необходим для приготовления растворов и питательных сред. Ав- токлав необходим для стерилизации. Оборудование для фильтрации (ваку- умная установка или шприц для фильтрации, мембранные фильтры) ис- пользуется для стерилизации субстанций, чувствительных к нагреванию. Ультразвуковая моечная машина полезна для очистки стеклянной и пла- стиковой посуды от устойчивых загрязнений. Холодильник с морозильной камерой нужен для хранения растворов и питательных сред (Watanabe, 2005).

2.1.3. Посуда

Разнообразная посуда (мензурки, различные колбы, бутыли, про- бирки, ампулы, цилиндры, чашки Петри, лопаточки, трубочки, шприцы и бюретки) используется для приготовления питательных сред, вклю- чая доступную стеклянную посуду. Кроме того, многие их этих наиме- нований посуды существуют и в виде одноразовой и многоразовой пла- стиковой, включая покрытый тефлоном пластик. Для подержания куль- тур водорослей широко используются пробирки с закручивающимися крышками и колбы Эрленмейера с силиконовыми крышками. Традиционные ватные пробки тоже применимы, однако они требуют опреде- ленного времени для приготовления. Силиконовые пробки могут ис- пользоваться многократно, и они обеспечивают лучший газообмен по сравнению с ватными пробками.

Существует огромное многообразие стеклянной посуды, однако не вся она пригодна для приготовления питательных сред и культиви- рования водорослей. Жаростойкая посуда из боросиликата, такая как Pyrex (Corning Co.Ltd.), DURAN (Shott Co.Ltd.) и HARIO (Hario Co.Ltd.), лучше всего подходит для приготовления растворов и пита- тельных сред. Посуда из боросиликата не влияет на рН растворов и со- став питательной среды и не подвергается быстрой коррозии.

Многие исследователи подчеркивают важность использования только химически чистой стеклянной посуды. Для этих целей могут использоваться различные чистящие реагенты. После очистки посуду необходимо ной водой промыть 1н. раствором HCl с последующим ополаскиванием или дистиллированной HNO3, затем водопровод- водой. После этого посуда должна быть высушена. Хранят такую посуду с со- блюдением правил стерильности.

Полиэтиленовая, поликарбонатная или покрытая тефлоном посу- да может использоваться вместо стеклянной посуды для хранения рас- творов отдельных следовых металлов, комбинированных растворов ме- таллов и растворов силикатов. Однако при этом небольшие количества металлов и кремниевые кислоты могут адсорбироваться и осаждаться на стенках бутылей. В результате этих реакций концентрация раствора будет изменяться, и конечная концентрация будет неизвестной (Wata- nabe, 2005).

2.1.4. Вода

Самые первые исследователи использовали ключевую воду, по- тому что талая и дистиллированная вода были сильно загрязнены ме- таллами. Э.Прингшхейм (Pringsheim, 1912) предложил использовать стеклянный аппарат для дистилляции при культивировании водорос- лей, так как металлический делал воду слишком токсичной. Сегодня качественная вода получается путем перегонки в аппарате однократной или двойной дистилляции с кварцевым стеклянным конденсором или конденсором Pyrex, а также с деонизацией воды с дальнейшей очисткой угольными или мембранными фильтрами (например, Milli-Q, Millipore Corp.). Уровень качества определяется чувствительностью как водо- рослей, так и процедуры, потому что более точные экспериментальные исследования требуют более высокого качества воды (Watanabe, 2005).

2.1.5. Агар

Обычно агар состоит из агарозы и агаропектина, которые загряз- нены различными примесями (Krieg, Gerhardt, 1981). Некоторые сорта агара содержат водорастворимые литические агенты против цианобак- терий. Для большинства культивируемых водорослей основным требо- ванием к агару является возможность его использования без дополни- тельной очистки. Для чувствительных водорослей требуется промыва- ние агара для очистки от примесей (Waterbury et al., 1986). Существуют две методики промывания агара:

– нагреть и растворить двукратную концентрацию агара в деионизо- ванной воде, затем охладить до застывания. Нарезать агар на кусочки и сполоснуть 1-2 раза в дистиллированной воде. Дистиллированная вода должна меняться ежедневно в течение 6-8 дней. Промытый агар с двукрат- ной концентрацией и двукратный объем среды должны быть автоклавиро- ваны в разных посудах и смешаны после охлаждения до состояния геля;

– поместить порошковый агар в большую мензурку с двукратно дис- тиллированной водой (например, 100г в 3л воды) и перемешать в течение 30 минут (Waterbury et al,. 1986). Дать агару осесть и вылить воду, повто- рить процедуру до полной очистки воды. Удалить воду (при необходимо- сти профильтровать) и промыть агар 3л этанола. Разделить этанол и агар путем фильтрации (например, с помощью фильтра Whatman 4 и колонки Бохнера). Затем сполоснуть агар аналитически проверенным ацетоном. Удалить ацетон и высушить агар при температуре 50 ?С в течение 2-3 дней. Хранить агар в хорошо закрытом контейнере.

Возможно, что даже промытый агар останется загрязненным следо- выми количествами компонентов, токсичных как для цианобактерий (Shi- rai et al., 1989), так и для других чувствительных водорослей. В этом слу- чае можно использовать более дорогую, но более чистую агарозу для мо- лекулярных исследований.

2.1.6. Почва

Жидкий почвенный экстракт или твердые частицы почвы использу- ются для выращивания видов водорослей в том случае, если нет необхо- димости в точных знания о потребностях в питательных веществах и обя- зательным условием является поддерживание нормальной морфологии. Успешность использования почвенной вытяжки зависит от выбора подхо- дящей почвы (Почвенные водоросли, 1969). Однако найти хорошую почву не очень просто. Например, из более чем 40 различных видов почв для культивирования хризофитовых водорослей пригодными оказались только две (Watanabe, 2005). В качестве хороших почв для культивирования водо- рослей можно рекомендовать почвы из садов и оранжерей, где они не об- рабатывались химикатами (различными пестицидами), почвы из заповед- ных лесов и лугов, не подвергающихся выпасу (Starr, Zeikus, 1993; Tomp- kins et al., 1995). Почва должна быть суглинистого типа, почвы с большим содержанием глины не подходят. Также не подходит кислая почва, а также почва, взятая из глубоких горизонтов. Для некоторых редких или чувстви- тельных водорослей иногда можно использовать хорошую почву около озер или водоемов, где они растут в естественных условиях. Однако почва должна быть отобрана над уровнем воды, поскольку ниже могут осаждать- ся различные токсиканты.

Удалив весь мусор (камни, листья, корни, черви), почву необходи- мо высушить при комнатной температуре или в сухожаровом шкафу при температуре менее 60 ?C. После высушивания почва должна легко из- мельчаться до состояния пыли. Для измельчения почвы можно исполь- зовать чистые ступку и пестик. Далее измельченную почву необходимо просеять через сито для удаления всех крупных частиц. Хранить почву следует в сухой посуде.

Для приготовления почвенной вытяжки необходимо взять 1 часть почвы и 2 части дистиллированной воды, после перемешивания смесь воды и почвы необходимо пастеризовать в течение 2 часов (Tompkins et al., 1995). Необходимо дождаться осаждения всех частиц, после чего жидкость следует профильтровать (например, с использованием фильтра Whattman). Экстракт должен быть подвергнут пастеризации или авто- клавированию еще раз. Раствор должен быть тщательно укупорен и хра- ниться при температуре 4 ?C.

Существует еще один более сложный метод приготовления поч- венной вытяжки с использованием щелочной экстракции. Подробное описание данного метода можно найти в статье Л.Провасоли с соавто- рами (Provasoli et al., 1957).