5.7. Специальные методы выделения водорослей

5.7.1. Выделение пикопланктона

Ультрапланктон (?5мкм) и пикопланктон (?2мкм) из-за своих мел- ких размеров представляют трудности при выделении. Самым простым методом изоляции мелких водорослей является выделение методов штриха на агаре. Крошечные пресноводные водоросли достаточно легко выделя- ются на агаре. Сложнее выделить океанские виды, однако для этих случаев имеются специальные модификации этого способа (Waterbury et al., 1986). Океанские виды можно также выделить методом разведения, однако таким образом не всегда удается выделить одиночные клетки.

Для изоляции пикопланктона можно использовать и традиционную методику выделения с помощью микропипетки. Для очищения клеток от разнообразных частиц необходимо иметь чистую каплю воды. Это особен- но важно для морских водорослей, так как в морской воде содержится большое число различных примесей (Jones, 1967). Разбавленная почвенная вытяжка, рекомендованная Е.Прингшеймом (Pringsheim, 1950), подходит для выделения не только крупных пресноводных организмов, но и для изоляции пикопланктона, если из нее предварительно будут удалены все частицы. Частицы могут также образовываться на поверхности стекла при автоклавировании. Стеклянная посуда иногда создает некоторые проблемы при выделении пикопланктона. Для предотвращения образования частиц в жидкости (например, морской воде, почвенной вытяжке или питательной среде) существует два простых метода. Одним из методов может быть фильтрация с помощью фильтра с отверстиями диаметром 0,2мкм. Другой метод заключается в том, что морской воде или питательной среде дают отстояться в течение 1-3 дней, после чего надосадочную жидкость акку- ратно отбирают с помощью пластиковой пипетки.

При выделении пикопланктона следует соблюдать условия стериль- ности, и ни в коем случае не допускать попадания пыли в используемую посуду и материалы. Перед использованием посуды ее необходимо обра- ботать кислотой, а затем несколько раз сполоснуть бидистиллированной или деионизированной водой. Посуду лучше стерилизовать в сухожаровом шкафу при температуре 250 ?С в течение 3ч. При автоклавировании воз- можно образование микрочастиц на поверхности сосуда, которые затем переходят в раствор. Лучше всего использовать предварительно стерили- зованную посуду, потому что ее поверхность не содержит частиц. Для этой цели очень хорошо подходят стерильные чашки Петри. Частицы могут об- разовываться также при стерилизации микропипетки в пламени. При вы- делении водорослей частицы копоти могут попасть в каплю с водорослями и затруднить их выделение. Таким образом, усилия исследователей долж- ны быть направлены на предотвращение попадания любых микрочастиц в раствор с водорослями, потому что эти микрочастицы очень трудно отли- чить от пикопланктона.

При выделении пикопланктона освещение является критическим моментом. При работе с бинокулярной лупой освещение по методу темно- го поля предпочтительнее проходящего света. При темнопольной иллюми- нации крошечные клетки отражают свет таким образом, что их можно увидеть при увеличении ?2 (рекомендуется использовать большее увели- чение). В жидкости клетки водоросли могут переворачиваться, и даже ма- ленькая вспышка света, исходящая от хлоропласта при вращении клетки позволяет отличить клетку водорослей от бактерий или других клеток. С помощью микропипетки можно захватить клетки и поместить в стериль- ную каплю. Очень важным моментом является использование маленькой капли, так как очень маленькую клетку трудно найти в большой капле. Не- обходимо работать очень быстро, так как маленькая капля может быстро испариться. С помощью инвертированного микроскопа можно легче выде- лить клетку.

Крошечные клетки часто бывают более чувствительными к компо- нентам питательной среды, и после успешного выделения клетка водорос- лей может погибнуть в питательной среде. Для океанских видов их лучше всего поместить в каплю морской воды на несколько дней. После появле- ния признаков нормального роста водоросли можно перенести в питатель- ную среду (Andersen, Kawachi, 2005).

5.7.2. Выделение водорослей, прикрепленных к субстрату

Некоторые организмы сильно прикрепляются к поверхности, и во избежание повреждения клеток при их изоляции, необходимо работать очень осторожно. При выделении таких необычных водорослей следует использовать и неординарные методы изоляции. Например, обработка ультразвуком или более сильное перемешивание в данном случае не под- ходят, так как клетки могут затеряться, что сделает невозможным их даль- нейшее выделение. Наиболее простым способом выделения таких водо- рослей является смыв струей воды из микропипетки. После смыва клетки следует быстро захватить, сполоснуть и поместить в среду для культиви- рования.

Некоторые прикрепленные водоросли (например, динофлагелляты) прикрепляются так сильно, что их невозможно отделить от субстрата с по- мощью струи воды. Существует другой метод выделения таких водорослей в культуру. Он основан на том, что некоторые водоросли, такие как Amphi- dinium restudo Herdman и Spiniferodinium, образуют подвижные клетки, но, к сожалению, период образования новых подвижных клеток сравнительно короток. При использовании данной методики обогащенные культуры изучаются несколько раз в течение одного дня, чтобы заметить начало об- разования новых, еще не прикрепившихся к субстрату клеток. Некоторые бентосные динофлагелляты образуют подвижные клетки через несколько часов после начала светлого периода суток. В этот период у исследователя появляется шанс для выделения таких клеток с помощью микропипетки.

Если перечисленные выше методы не дают нужного результата, мо- гут быть предприняты более решительные попытки к их выделению. Рас- смотрим пример отделения водорослей, прикрепленных к пластиковому субстрату (например, чашки Петри или пластиковые тарелки). В этом слу- чае нежелательный материал может быть удален вокруг нужной клетки с помощью тонкой кисточки для рисования (для удаления более крупных частиц) или микропипетки (для удаления более мелких частиц). Далее, ис- пользуя бритву или скальпель, осторожно вырезают часть сосуда вокруг клетки и переносят кусочек пластика вместе с содержащимися клетками в новый сосуд для культивирования (Andersen, Kawachi, 2005).

5.7.3. Выделение аэрофильных водорослей

Аэрофильные эпифитные водоросли растут на субстратах, находя- щихся в воздушной среде (например, коре деревьев, листьях, камнях и почве, зданиях и т.д.). Разнообразие водорослей, обитающих на этих суб- стратах, удивляет. Например, Дж.Фоерстер (Foerster, 1971) обнаружил 77 родов в лесах Пуэрто-Рико, другие альгологи (Schlichting, Milliger, 1969) выделили 91 вид микроорганизмов (в основном водорослей), обитающих на гигантском водяном жуке Lethocerus. Наиболее изученной группой во- дорослей являются почвенные водоросли (Ettl, Gartner, 1995), хотя водо- росли, обитающие на других субстратах, тоже довольно хорошо исследо- ваны (Brook, 1968; Schlichting, 1969, 1975). Образцы отбирают путем со- скабливания, разделения на кусочки и т.д. Способы выделения таких водо- рослей также разнообразны, но чаще всего используется метод обогащен- ных культур и метод непосредственного выделения. Существует интерес- ная методика выделения аэрофильных водорослей (Schlichting, Milliger, 1969), основанная на погружении водяного жука прямо в питательную среду. При непосредственном выделении клетки могут быть помещены на поверхность агара, а колонии, образовавшиеся позже из этих одиночных клеток, могут быть помещены в среду для культивирования.

Водоросли, обитающие на поверхности водоемов («seafoam»), зани- мают положение между субаэриальными и аэриальными водорослями. Их можно отбирать с помощью ножа или ложки, затем поместить в стериль- ный пластиковый пакет, а затем в лабораторных условиях культивировать с использованием классических методов. Такие накопительные культуры являются источником многочисленных водорослей, преимущественно пре- сноводных.

Аэриальные водоросли изучены меньше, чем субаэриальные (Schlichting, 1969; Smith, 1973). Так, например, П.Смит (Smith, 1973) выде- лил 44 вида водорослей в Ралегхе (Северная Каролина). Методы отбора образцов аэриальных водорослей без загрязнения подробно описаны в ста- тье Х.Шлихтинга с соавторами (Schlichting et al., 1971).

5.7.4. Выделение эпифитов после обработки ультразвуком

Эпифитные водоросли, обитающие на более крупных водорослях или других организмах, достаточно трудно выделить с помощью микропи- петки. Если попытаться соскоблить эпифиты, то можно повредить их клет- ки. В этом случае наиболее оптимальным вариантом является обработка ультразвуком. Этот способ позволяет нужным клеткам водорослей перейти в раствор, из которого их можно легко выделить (Brown, Bischoff, 1962; Hoshaw, Rosowski, 1973).

5.7.5. Выделение водорослей, живущих в песке

Песок является обычным субстратом для сообществ эпипелона (Round, 1981). В песке обитают два вида водорослей: флагелляты, которые свободно плавают среди песчинок и водоросли, которые растут, прикреп- ляясь к песчинкам. Первые намного легче выделить, чем последние, так как песчинки помимо водорослей могут содержать и другие прикреплен- ные организмы.

Рассмотрим метод выделения водорослей, свободно плавающих среди песчинок. Во время сбора образцов верхний слой песка собирается с помощью стеклянной пробирки, бутылки с широким горлышком или ма- леньким совком. Ф.Раунд (Round, 1981) предложил помещать песок и воду в чашки Петри, а затем собирать клетки водорослей, поднявшиеся наверх, с помощью микропипетки, или позволять им расти на плавающих покров- ных стеклах. Стекла потом извлекаются с помощью пинцета и потом ис- следуются с помощью микроскопа. В случае обогащенных культур по- кровные стекла помещаются в чашки Петри со стерильной средой, покры- ваются парафильмом и инкубируются.

Существует другой метод выделения. Небольшое количество песка помещают в прозрачную пластиковую чашку с крышкой, куда добавляют необходимое количество питательной среды. Потом чашку наклоняют та- ким образом, чтобы песчинки оказались на одной стороне. Когда песок осядет, чашку снова переворачивают в нормальное положение. На другой стороне чашки устанавливают преграду для песка (например, палочки для еды) таким образом, чтобы образовалась своеобразная камера для культи- вирования. Затем с помощью бинокулярной лупы изучают клетки и отде- ляют нужные для дальнейшего культивирования.

М.Хоппенрат (Hoppenrath, 2000) отделял прикрепленные к песку ди- нофлагелляты, помещая замерзшую морскую воду на фильтр (с диаметром пор 0,45 мкм). По мере таяния жидкость проходит через песок и вымывает водоросли. Этот метод представляет собой модификацию, предложенную Г.Ухлингом (Uhling, 1964).

Выделение водорослей из грязи является более трудной задачей, по- тому что грязь не оседает на дно. Для выделения водорослей можно ис- пользовать метод прикрепления к покровным стеклам и метод разведения. Выделение с помощью микропипетки возможно только при сильном раз- бавлении грязи.

5.7.6. Выделение цист из осадков

Осадочные образцы содержат большое количество разрушенных ор- ганических остатков, что препятствует выделению водорослей. Для выде- ления флагеллят осадки могут обогащаться питательными веществами и инкубироваться на свету для прорастания цист. После прорастания цист водоросли могут быть выделены с помощью методов, описанных выше. В свою очередь цисты могут быть отделены от осадков с помощью несколь- ких методов (Wall et al., 1967; Matsyoka, Fukuyo, 2000). В этом случае кон- центрированные цисты могут быть собраны, промыты, а затем отдельные цисты могут быть помещены в контейнер для дальнейшей изоляции.

В некоторых случаях при прорастании цист происходит изменение плоидности (например, диплоидные цисты делятся митотически, производя гаплоидные клетки). Если важно выделить каждую гаплоидную клетку (например, при изучении полового размножения), применение в дальней- шем метода обогащенных культур невозможно. В этом случае необходимо изолировать каждую цисту путем пересадки в отдельный сосуд для куль- тивирования (например, в пластиковую планшету) для того, чтобы можно было отслеживать процесс прорастания. Наблюдение ведут через каждые 1-2 часа. После прорастания цист четыре гаплоидные клетки должны быть выделены индивидуально и перенесены в культуру. Штамм водоросли, по- лученный из этих одноклеточных изолятов, должен содержать как жен- ские, так и мужские клеточные линии (Andersen, Kawachi, 2005).

5.7.7. Выделение водорослей, обитающих в проточных водоемах

Некоторые виды, особенно растущие в проточной воде, для нор- мального роста требуют движения воды (то есть они погибают при выра- щивании в обычных сосудах). Для культивирования таких водорослей не- обходимо использовать специальные вращающиеся сосуды (например, производства Bellco., Inc.) в комплекте с необходимым оборудованием для создания движения. Таким же образом можно поместить сосуд для культи- вирования в специальное устройство для создания движения воды.

Таким образом, выделение водорослей представляет некоторые сложности для начинающих исследователей, однако при наличии доста- точной практики можно быстро получить необходимые навыки. Во многих случаях изобретательность может облегчить этот процесс как в хорошо оборудованной лаборатории, так и полевых условиях. Наличие необходи- мого оборудование позволяет сделать процесс выделения водорослей бо- лее легким и успешным. При выделении таких водорослей оборудование может потребоваться в любой момент, поэтому все необходимые материа- лы нужно хранить в стерильном состоянии (Andersen, Kawachi, 2005).

5.7.8. Удаление диатомовых водорослей с помощью диоксида германия

Диатомовые водоросли могут создавать проблемы для ученых, пы- тающихся их выделить. Диатомеи растут очень быстро, и их бурный рост тормозит развитие других водорослей. В большинстве случаев добавление диоксида германия в образец, накопительную культуру или выделенную культуру, загрязненную диатомовыми водорослями, ведет к гибели боль- шинства или всех диатомовых водорослей (Lewin, 1966). Германий заме- щает кремний в биохимических реакциях, что приводит к их гибели. Для большинства других водорослей (за исключением красных водорослей) высокие концентрации германия не являются токсичными (McLachlan et al., 1971). Эффект диоксида германия достигается при его концентрации от 1 до 10мг/л. Токсичность диоксида германия во многом определяется и временем внесения. При получении накопительных культур диоксид гер- мания лучше всего добавить сразу же. Если добавить диоксид германия уже после развития диатомовых водорослей, для удаления диатомей пона- добиться значительно больше времени.

5.7.9. Удаление синезеленых водорослей с помощью антибиотиков

Синезеленые водоросли могут также мешать развитию других групп водорослей. К счастью, синезеленые водоросли можно эффективно уда- лить с помощью антибиотиков, так как они являются прокариотами. Одна- ко одни антибиотики более эффективны, другие менее. Но в большинстве случаев методом проб и ошибок можно найти нужную комбинацию анти- биотиков, а также рассчитать необходимые концентрации.

Контрольные вопросы 1. Кто впервые описал методы выделения водорослей? 2. Какие факторы влияют на выделение водорослей? 3. Какова методика отбора образцов в природных условиях? 4. Перечислите материалы и оборудование, необходимые для выделения водорослей. 5. Какова методика получения накопительных культур? 6. Укажите основные способы выделения водорослей в культуру. 7. Опишите методику выделения водорослей с помощью микропипетки. 8. Перечислите специальные методы выделения водорослей, используемые в практике альгологических исследований.