5.6. Стандартные методы выделения водорослей

5.6.1. Накопительные культуры

Накопительные культуры являются только первым шагом в про- цессе выделения чистых культур. Они являются результатом обогаще- ния питательными веществами образца с водорослями. В качестве обогащающих субстанций используют питательные среды, почвенную вытяжку, макроэлементы (нитраты, аммоний и фосфаты), а в ряде случаев и микроэлементы. Почвенная вытяжка, возможно, является наиболее простой и самой подходящей средой при условии, что для ее приготовления использовалась почва высокого качества (Pringsheim, 1950). Для обогащения почвенной вытяжки, используемой для выра- щивания десмидиевых и некоторых других водорослей из кислых ме- стообитаний, в почвенную вытяжку можно добавить сфагнум. Орга- нические субстанции, такие как экстракт дрожжей (для обогащения витаминами), казеин (для аминокислот), могут быть добавлены в сре- ду для выделения осмотрофных водорослей. Однако эти вещества нужно добавлять в очень низких концентрациях, так как они могут вызвать сильный рост бактерий. Бурное размножение бактерий приво- дит к увеличению токсичности культуры и последующей гибели водо- рослей. Для культивирования видов, никогда ранее не выделявшихся в культуру, исследователю иногда приходится искать новые подходы. М.Друп (M.Droop) пытался добавлять небольшие количества экстрак- тов разных фруктов в культуру фитопланктона при выделении Oxyr- rhis. Он установил, что добавление свежевыжатого лимонного сока и экстракта лимонных корок дает положительный эффект (Droop, 1966, 1971).

Для питания миксотрофных бактерий можно добавить сухое зер- но риса, которое быстро удовлетворяет потребность в органических веществах. Контролируемый рост бактерий, в свою очередь, обеспе- чивает питание для фаготрофных водорослей (например, Ochromonas, Chrysophyceae). Зерна риса не следует автоклавировать вместе со сре- дой, так как при этом они становятся слишком мягкими и рассыпча- тыми, что способствует развитию на их поверхности некоторых пато- генных микроорганизмов. В среду для культивирования можно добав- лять растворимые органические вещества, такие как глюкоза, ацетат или экстракт дрожжей. Однако количество растворенных органиче- ских веществ должно быть уменьшено при выращивании хризофито- вых флагеллят и других медленно растущих миксотрофов. Для выде- ления эвгленовых водорослей в почвенную вытяжку иногда добавляют различные семена, например, 1/4 горошины, однако в этом случае зерно добавляется в качестве дополнительного источника аммония и ор- ганических веществ (Andersen, Kawachi, 2005).

Природные образцы часто лишены одного или более питательных веществ, однако в природе водоросли выживают, так как жизнедеятель- ность бактерий и гибель организмов восполняет этот дефицит. В отобран- ном образце это восполнение уменьшается или совсем прекращается, и этот питательный стресс может вызвать гибель нужного вида. Таким обра- зом, для некоторых видов небольшое обогащение может продлить жизнь здоровых клеток водорослей, необходимых для выделения культуры. Обо- гащение полевых образцов может быть эффективным для океанических видов, когда отбор проб ведется на корабле, особенно во время длитель- ных путешествий. В этих случаях добавление очень небольшого количест- ва питательной среды или раствора солей позволяет культуре сохраниться до конца путешествия. Однако обогащение может быть вредным для водо- рослей в зависимости от места культивирования. Например, если нужный вид является редким и не может конкурировать с более широко распро- страненными видами, обогащение может снизить численность этого вида. В этом случае лучше не обогащать образец. Обогащенную культуру лучше хранить в специальном шкафу для инкубации, проверяя состояние нужно- го вида. После получения хорошо растущей культуры выделяют этот вид. Если водоросль хорошо растет в обогащенной культуре, это облегчает е? выделение.

Для подбора оптимального вещества для обогащения можно провес- ти следующий эксперимент. В 10 пробирок нужно поместить по 10мл сре- ды, и в каждую из пробирок добавить разные добавки (нитраты, фосфаты, силикаты, аммоний, железо и т.д.). Кроме того, можно попытаться сме- шать разные добавки. Затем в каждой из пробирок можно будет обнару- жить различные организмы, в зависимости от того, какие добавки эти ор- ганизмы предпочитают. Более того, в некоторых пробирках можно будет обнаружить организмы, не обнаруженные в среде до обогащения (Andersen, Kawachi, 2005).

В каком количестве нужно обогащающие добавки? Хотя ответ на этот вопрос зависит от образца и среды, в целом ответ будет таков: «не очень мно- го». Максимальное количество добавки – столько же, сколько содержится в обычной среде, содержащей этот компонент, минимум – одна тысячная доля этого количества. Например, приблизительно 800 мкмоль нитрата эквива- лентно его количеству, содержащемуся в среде f/2 (Guillard, 1975), которая используется для роста водоросли Skeletonema, но для выделения одиночных клеток кокколитофоров лучше использовать нитрат в количестве 800 нано- моль. Во-вторых, добавку можно вносить постепенно (например, 800 нано- моль нитрата в первый день, еще 800 наномоль на десятый и т.д.). Если био- масса водоросли удваивается, то и добавку тоже надо удваивать. Для видов с r-отбором (например, Skeletonema) большое количество нитрата не только полезно, но и необходимо. Наоборот, для видов c k-отбором (океанских кок- колитофоров), растущих очень медленно, требуется небольшое количество добавок. В таких условиях r-виды погибают, и спустя определенное время k- виды становятся доминантами.

Добавление аммония особенно полезно для видов, нуждающихся в этом компоненте (например, для Aureoumbra). В некоторых случаях (на- пример, для Aureococcus) концентрации аммония свыше 20мкммоль явля- ются летальными. Таким образом, эти два вида водорослей, так похожие друг на друга во многих отношениях, различаются по своей потребности в питательных веществах.

Выборочное культивирование является разновидностью обогащен- ного культивирования для специальных целей. Если целью является выде- ление микроводорослей, которые могут расти при высоких концентрациях углекислого газа, тогда среды обогащают углекислым газом. Таким же об- разом могут быть составлены селективные культуры и по отношению к другим факторам (высокая и низкая температура, свет, соленость, рН). Специальные физические условия могут оказать сильное воздействие на рост культур. Например, некоторые бентосные диатомеи, особенно круп- ные Pinnularia, лучше развиваются при наличии осадка, по которому они могут двигаться и расти (Andersen, Kawachi, 2005).

5.6.2. Выделение клеток с помощью микропипетки

Этот метод является наиболее распространенным методом выделе- ния водорослей. В этом методе используется микропипетка Пастера или стеклянный капилляр. Для этого пипетку Пастера нагревают в пламени спиртовки, вытягивают с помощью пинцета и ломают (рис. 14).

После некоторой практики эта процедура становится быстрой и легкой. Пипетку следует держать в одной руке, в другой руке следует держать пин- цет, придерживая наконечник. Пипетки следует слегка покручивать, обеспе- чивая ее размягчение в точке плавления. Когда нагреваемый участок распла- вится, пипетку двигают в пламени и постепенно вытягивают для получения тонкой трубочки. Если пипетку растягивать быстро и делать это в пламени горелки, то получается очень тонкая ниточка. Некоторые исследователи предпочитают работать с прямыми пипетками и затем загибать у них кончик. Изогнутый кончик удобен для того, чтобы достать водоросли из глубокой емкости, но прямой наконечник удобен для того, чтобы поместить водоросль в каплю воды. После вытягивания кончика пипетки его следует остудить в течение пары секунд. Затем пинцетом нужно найти участок в самом тонком месте, лучше всего перед изгибом вниз. Затем легким движением нужно сло- мать пипетку и отломанный конец выбросить. Если конец пипетки получился зубчатым, надо повторить всю процедуру, так как неровный конец не позво- лит захватить нужную клетку.

Некоторые исследователи делают сразу несколько микропипеток, в то время как другие предпочитают делать пипетку непосредственно перед использованием. Использованную ранее пипетку можно снова использо- вать для получения новых стерильных наконечников, при условии, что во- да не попала в пипетку при предыдущем использовании. При повторном использовании пипетки, погружаемой в морскую воду, на стенках часто образуются микроскопические корки из соли.

Рис. 14. Приготовление микропипетки из пипетки Пастера (Andersen, Ka- wachi, 2005): a - пипетку Пастера нужно держать над самой горячей частью пламени, держа ее в левой руке. В правой руке нужно держать щипцы, пи- петку нужно поворачивать до тех пор, пока стекло не расплавится; b – ко- гда стекло расплавится, пипетку нужно вытянуть над пламенем таким об- разом, чтобы поучилась тонкая трубочка; c - затем пинцет нужно передви- нуть к самому тонкому участку трубочки; d – легким движение щипцов сломать трубочку в самой тонкой части, в результате чего образуется мик- ропипетка; e – если пипетка получилась с неровными краями, ее нужно выбросить, так как она непригодна для работы; f – если края пипетки ров- ные, то тогда эта пипетка пригодна для работы. Диаметр кончика пипетки должен быть больше диаметра клетки водоросли, имеющей жгутики, что уменьшит риск повреждения жгутиков во время изоляции

Целью изоляции с помощью микропипетки является захват клетки водоросли из образца, перенесение клетки без повреждения в стерильную каплю, новый захват клетки, и перенесение клетки в новую стерильную каплю. Этот процесс повторяется до тех пор, пока одиночная клетка водоросли, свободная от других протист, может быть перенесена в среду для культивирования (рис. 15).

Рис. 15. Использование пипетки для удаления нежелательных организмов (Andersen, Kawachi, 2005). В левой и средней части рисунка показано, как удаляются нежелательные организмы, при этом в правой части рисунка показано, что нужный организм остается в стерильной капле

Для организмов с прочной клеточной оболочкой даже многоэтапная процедура изоляции не страшна, однако выделяя водоросли с нежной обо- лочкой, нужно всегда помнить об осторожности.

При выделении водорослей необходимо использовать микроскоп. Образец, содержащий нужный вид, может быть перенесен в стеклянную или пластиковую чашку, планшету или любой другой контейнер. Стериль- ная капля воды должна быть подготовлена до начала процесса выделения. Иногда (Lewin, 1959) рекомендуется помещать каплю на агар для умень- шения испарения, однако это не всегда необходимо. Кроме того, агар не прозрачен, как стекло или пластик, и очень мелкие клетки на нем трудно разглядеть. Стерильная капля может состоять из стерильной морской, озерной или речной воды, или питательной среды. Водоросли должны вы- живать в капле, не испытывая стресса. Например, пресноводные водоросли погибают в морской воде или концентрированной питательной среде.

Существует два обычных метода для захвата отдельных клеток с по- мощью микропипетки.

Суть первого метода заключается в следующем. Гибкий резиновый шланг нужно соединить с мундштуком и с микропипеткой или капилляр- ной трубкой. Лучше всего использовать тонкий шланг, так как он имеет меньший вес, однако это потребует использования специальных соедини- тельных трубок. Можно приобрести специальные соединительные трубки, однако в этом качестве можно использовать и части пипеток Пастера или пластиковых трубочек. Короткий конец шланга, соединенный с соедини- тельной трубкой, обеспечивает быстрое и легкое крепление с микропипет- кой. Можно использовать и более толстый шланг, однако это затруднит его использование. Толстый шланг обычно отрезают со стороны более длинного конца так, чтобы шланг можно было бы пропустить по плечам и шее для удобства при использовании. Хотя для соединения крупных шлан- гов можно использовать различные устройства для соединения, очень хо- рошо подходит наконечник для 1000мл пластиковой пипетки.

Исследователь помещает небольшое количество стерильной воды в микропипетку. Затем нужно поместить конец микропипетки рядом с нужной водорослью и втянуть каплю ртом для того, чтобы водоросль попала в микропипетку. После успешного захвата нужной клетки, ко- нец пипетки нужно переместить в стерильную каплю, затем в следую- щую каплю и так далее. Эти операции нужно выполнять с осторожно- стью, чтобы не повредить клетку.

Согласно другой методике конец микропипетки может быть по- мещен в стерильную каплю таким образом, что в результате капилляр- ной силы вода попадет в микропипетку. Если сухую пипетку погрузить в образец (например, без погружения наконечника в стерильную кап- лю), то в результате капиллярной силы в пипетку могут попасть неже- лательные частицы. После погружения в стерильную жидкость микро- пипетку подводят к выбранной клетке, и остаточная капиллярная сила засосет клетку в микропипетку. Затем конец микропипетки с нужной клеткой нужно перенести в следующую стерильную каплю, и клетку можно освободить путем выдувания.

Иногда стерильная капля, наряду с нужной клеткой водоросли, может содержать и другие частицы. Используя методику, описанную выше, можно перенести нужную клетку в следующую стерильную кап- лю. Эту процедуру можно повторять до тех пор, пока исследователь полностью не очистит клетку, которую затем можно поместить в ем- кость с питательной средой.

Диаметр конца пипетки должен быть по крайне мере в два раза больше диаметра клетки водоросли, но не больше, чем в несколько раз. Если диаметр пипетки будет меньше, это может повредить клетку при выделении, особенно если клетки голые или имеют жгутики. Если мик- ропипетка имеет слишком большой наконечник, это может затруднить захват клетки и будет способствовать проникновению в пипетку неже- лательных частиц. При выделении нитчатых водорослей, а также водо- рослей, образующих цепочки или одиночных длинных клеток (напри- мер, некоторых пеннатных диатомей), микропипетку следует направлять к концу нити, цепочки или клетки. Микропипетку лучше держать под углом, чтобы клетки или нити можно было захватить без сильной деформации (Andersen, Kawachi, 2005).

Некоторые клетки обитают на дне чашки Петри. Попытки выделить эти клетки часто приводят к их повреждению и гибели. Быстрая обработка клеток может помочь в решении этой проблемы. Для этого клетки нужно достать сразу же после того, как будет отобран образец, чтобы водоросли не успели осесть на дно и там закрепиться. Затем клетку как можно скорее перенести в стерильную каплю. Эту процедуру нужно повторять до полной очистки клеток. При этом надо наблюдать за тем, чтобы водоросли не при- крепились к стенкам пипетки.

Хотя все методы выделения основаны на изоляции одиночных кле- ток – начиная с оригинального образца до выделения клеток в культуру – это не исключает использования и других подходов. Опытный исследова- тель может выделять несколько клеток и доводить их от природного об- разца до чистой культуры. Имея опыт, можно оценить жизнеспособность клеток. Для флагеллят прекращение плавания может быть признаком по- вреждения. Поврежденные клетки диатомей могут отражать свет иначе, чем нормальные клетки. Вытекание протоплазмы является очевидным признаком серьезных повреждений.

Другим подходом является выделение нескольких нужных клеток в питательную среду, которую нужно защитить от высыхания (например, с помощью парафильма). Затем эти клетки нужно оставить на период от не- скольких минут до нескольких дней. Впоследствии жизнеспособные клет- ки могут быть отобраны, так как их можно будет отделить от поврежден- ных и мертвых клеток. Наконец, во многих случаях при использовании этой методики можно легко освободиться от клеток-загрязнителей. Этот метод уменьшает затраты времени на выделение нужных клеток, так как усилия исследователей направлены только на удаление загрязнителей. По- сле удаления всех загрязнителей нужную клетку можно поместить в сте- рильную питательную среду.

Еще одна методика работы с микропипетками может быть использо- вана для определения повреждения клеточных стенок некоторых диато- мей, особенно крупных, и может быть полезна для получения клональных штаммов, которые могут быть двудомными. Кроме того, целенаправлен- ные повреждения клеточных оболочек служат немаловажным фактором для нивелирования физического ограничения регенерации размеров. На- пример, ряд авторов (Rogerson et al., 1986) применяли этот метод для полу- чения голых клеток Coscinodiscus asterophalus, используя повторную ин- тродукцию клеток, помещенных в 1% раствор папаина (Andersen, Kawachi, 2005).

82

5.6.3. Выделение клеток с использованием агара

5.6.3.1. Посев штрихом

Выделение водорослей на агаровых чашках также является одним из старейших и распространенных методов. Этот способ предпочтителен для выделения многих коккоидных и большинства почвенных водорослей. По- пулярность метода объясняется не только его легкостью, но и тем, что ак- сеничные культуры могут быть получены без использования других про- цедур. Для успеха этого метода водоросли должны растить на агаре. Неко- торые флагелляты (например, Heterosigma, Pelagomonas, Peridinium) не растут на агаре, другие (например, Chlamydomonas, Pavlova, Synura, Tetra- selmis) растут очень хорошо. Коккоидные клетки обычно очень хорошо растут на агаре, за некоторыми исключениями (например, Aureococcus, Au- reoumbra). Большинство диатомовых водорослей и некоторые криптофиты тоже хорошо растут на агаре.

В большинстве случаев концентрация агара не является определяю- щим фактором, она может колебаться от 0,8% до 1,5-2%. Некоторые водо- росли растут на «мокром» агаре (с концентрацией 0,3-0,6%), однако боль- шинство водорослей все же хуже растут на влажных агаризованных по- верхностях.

Агар также является хорошей средой для роста грибов и бактерий. Полевые образцы с существенным грибным загрязнением могут принести много неприятных сюрпризов, так как грибы растут очень быстро, образуя спорангии и споры, затрудняя выделение водорослей. Для удаления нитей можно использовать фильтры и органические вещества. Если рост грибов наблюдается в чашках Петри, то их лучше сразу выбросить, не открывая. Наоборот, бактерии часто образуют маленькие ограниченные колонии, и одновидовые культуры можно получить, если их аккуратно перенести с поверхности твердой среды. Исключение составляют бактерии из образцов бентоса, отобранные в тропиках, поскольку они часто содержат бактерии, которые «растворяют» участки на поверхности агара.

Выделение водорослей методом «штриха» аналогично методикам, используемым для изоляции бактерий. Микробиологической петлей берут небольшое количество образца, который потом распределяют по поверх- ности среды, используя одну из нескольких методик (рис. 16).

Сначала штрихи содержат большое число водорослей, однако по ме- ре движения петли число клеток уменьшается до одиночных клеток. После посева водорослей чашки инкубируют до начала роста колоний. Время ин- кубации варьирует от нескольких дней для почвенных и пресноводных во- дорослей до нескольких месяцев для океанических видов. Затем колонии, образованные потомками отдельных клеток, выделяют в культуру. Коло- нии можно отделить с поверхности агара при помощи микропипетки или нихромовой (платиновой) микробиологической петли. Микропипетку обычно используют в сухих условиях. Если пипетка «загружена» стериль- ной жидкостью, то небольшое количество жидкости может рассеяться по колонии. Когда конец микропипетки коснется колонии, некоторое число клеток попадает в пипетку. Затем микропипетку нужно быстро опустить в сосуд с питательной средой или в другую чашку Петри. Клетки следует осторожно выдуть из пипетки. Водоросли можно также посеять штрихом на другую агаровую чашку. Если клетки были выделены из отдельных клеток с соблюдение правил стерильности, постепенно можно получить чистую аксеничную культуру (Andersen, Kawachi, 2005).

Рис. 16. Выделение водорослей методом «штриха» (Andersen, Kawachi, 2005). На фото можно увидеть, как на агаре по маршруту движения петли развиваются одиночные колонии водорослей

5.6.3.2. Культивирование водорослей внутри агара

Некоторые водоросли не растут на поверхности агара, но очень хо- рошо растут внутри него. Впервые эту методику использовал М.Бейеринк, однако он использовал вместо агара желатин. К.Скиннер (C.Skinner) при- менял интересную модификацию этого метода: он наливал агар в пробир- ки с водорослями, а потом, после инкубации, разбивал пробирки и доста- вал колонии водорослей (Andersen, Kawachi, 2005). Е.Прингшейм (Pring- sheim, 1946) обобщил историю методики выращивания внутри агара.

Позднее эту методику стали использовать для выращивания океанских пи- копланктонных видов (Brahamsha, 1996; Toledo, Palenik, 1997). Для полу- чения погруженных в агар колоний клетки из полевого образца или обога- щенной культуры смешивают с жидким агаром и потом разливаются в чашки Петри. Агар должен быть прохладным – чуть выше температуры за- стывания – для предотвращения чрезмерного нагревания водорослей. Для этих целей лучше использовать агар с низкой температурой застывания. После этого чашки нужно остудить. Затем колонии нужно инкубировать при нужной температуре и освещенности до появления колоний водорос- лей. Потом можно выделить нужные водоросли с помощью микропипетки и поместить в жидкую питательную среду. Хотя с помощью этой методики можно поддерживать культуру достаточно длительное время, все же в большинстве случаев способ выращивания клеток внутри агара использу- ется для выделения культуры (Andersen, Kawachi, 2005).

5.6.3.3. Методика автоматизированного распыления

Этот способ может использоваться для посева водорослей в чашки Петри. Методика может варьировать, однако суть метода состоит в распы- лении суспензии клеток водорослей с помощью специальных устройств (Pringsheim, 1946). Для достижения лучших результатов эту процедуру лучше проводить в стерильном боксе, чтобы бактерии и грибы не попали в чашку. После инкубирования клеток выросшие колонии водорослей пере- носят в жидкую питательную среду.

5.6.3.4. Выделение водорослей методом перемещения через агар

Агаровые чашки могут быть использованы для отделения нитчатых водорослей от эпифитов в качестве одного из этапов процесса выделения. Существует много различных вариаций этой методики. Обычно при ис- пользовании данного метода исследователи изготавливают из пипетки Пастера крючок, и с помощью этого крючка протаскивают нить через агар. Для более крупных нитей используется металлический крючок. Затем очищенная нить помещается в жидкую питательную среду или в чашку с агаром (Andersen, Kawachi, 2005).

5.6.4. Метод разбавления

Метод разбавления используется уже в течение многих лет, он эф- фективен для организмов, которые содержатся в образце в большом коли- честве, но неэффективен для редко встречающихся организмов. Целью ме- тода разбавления является помещение клеток в пробирку, колбу или «гнез- до» пластиковой планшеты с последующим получением одноклеточных изолятов (Kufferath, 1928/29, Droop, 1954, Throndsen, 1978) (рис. 17).

Если знать приблизительную концентрацию клеток, то можно легко вычислить необходимое разведение, чтобы небольшой объем раствора (например, одна капля, 50 мкл, 1мл) содержал одну клетку. Если прибли- зительная концентрация клеток неизвестна и не может быть быстро вы- числена, то можно приготовить серию разбавленных растворов, уменьшая концентрацию от разведения к разведению в 10 раз. В большинстве случа- ев пятое или шестое разведение имеет необходимую концентрацию клеток (так, например, если в шестом разведении одна капля содержит одну клет- ку, то концентрация в первоначальном растворе была 106 клеток?мл-1).

Рис. 17. Иллюстрация метода разбавления (Andersen, Kawachi, 2005). Али- квота берется из емкости с полевым образцом (слева) и помещается в про- бирки, содержащие стерильную среду. После перемешивания, одна алик- вота берется из пробирки и распределяется в планшету, содержащую сте- рильную среду, вторая аликвота добавляется в средние гнезда. После пе- ремешивания процесс повторяется (распределение в гнезда и добавление в пробирки справа). Каждый цикл заключается в разбавлении природного образца и увеличивает возможность выделения отдельных клеток

Метод разбавления является наиболее распространенным методом, используемым при культивировании случайных видов из полевых образ- цов, особенно если целью исследователя является открытие новых видов. Применяются различные варианты этой методики. Во-первых, разведение может проводиться в питательной среде, дистиллированной воде (для пре- сноводных организмов), морской воде (для морских организмов), отфильт- рованной воде из полевого образца, или комбинации из этих растворов. Питательная среда может содержать все соли, необходимые для выделения широко распространенных организмов, или же быть очень разбавленной для редких видов. Во-вторых, усилия исследователей могут быть направ- лены на концентрации, при которых возможно выделение отдельных кле- ток (10, 50, 100 попыток). Обычно делают большое количество пробирок из последнего разведения, принимая во внимание, что в некоторых про- бирках клетки могут погибнуть, другие могут содержать несколько видов, а в следующих водоросли вообще могут отсутствовать. В-третьих, в неко- торые пробирки могут быть добавлены микроэлементы (например, аммо- ний, селен), если целью является выделение видов, которые нуждаются в этих добавках. Таким же образом можно инкубировать водоросли при раз- ной температуре и освещенности. При помощи этой методики редко уда- ется получить аксеничные культуры, так как бактерии более многочислен- ны, чем водоросли (Andersen, Kawachi, 2005).

5.6.5. Разделение водорослей центрифугированием и осаждением

Разделение водорослей на основе силы тяжести может быть эффек- тивным для разделения организмов, различающихся по размерам. Для это- го используют два метода: центрифугирование и осаждение. Сила тяжести, возможно, чаще используется для концентрации нужных организмов, чем для получения одновидовых культур. Целью этой процедуры является от- деление более крупных и тяжелых клеток от более мелких клеток и бакте- рий. Легкая фильтрация в течение короткого времени может использовать- ся для очистки диатомовых водорослей и динофлагеллят от более мелких клеток. Эту процедуру можно повторять до полной очистки культуры. Для быстро плавающих динофлагеллят этот процесс нужно проводить очень быстро, так как водоросли могут уплыть обратно в жидкость. Кроме того, сильное центрифугирование может повредить клетки, особенно нежные организмы со стрекательными клетками. Сила и скорость центрифугиро- вания зависит от вида водоросли и определяется эмпирически. Центрифу- гирование с использованием градиента плотности (например, силикатных солей) также может использоваться для разделения лабораторных культур (Reardon et al., 1979).

Метод осаждения применяется для разделения неподвижных круп- ных или тяжелых клеток. Образец слегка встряхивается и помещается в пробирку, колбу, цилиндр или другой сосуд для осаждения. Осаждение проводят до тех пор, пока бoльшая часть нужных клеток не осядет на дно, в то время как более мелкие клетки будут оставаться в растворе. После этого верхняя часть раствора сливается. Этот процесс можно повторять до получения нужного результата.

Как центрифугирование, так и осаждение эффективны для концен- трации крупных клеток, однако с помощью этих методов трудно получить одновидовые культуры или выделить отдельные клетки. Для этих целей нужно комбинировать центрифугирование и осаждение с другими метода- ми (фильтрацией, изоляцией клеток с помощью микропипеток и т.д.) (An- dersen, Kawachi, 2005.

5.6.6. Выделение с использованием фитотаксиса

Фототаксис может быть использован для выделения флагеллят (Bold, 1942). Этот метод эффективен, если образец содержит один доминирую- щий вид флагеллят, обладающий фототаксисом. Если таких видов не- сколько, то процесс выделения отдельных видов затрудняется. Для этого метода необходима установка, включающая источник света. Самая простая установка представляет собой трубку со стерильной средой, на одном кон- це которой находится образец с водорослями, а на другом – источник све- та. После того как клетки продвинутся на достаточное расстояние в сте- рильную жидкость, они могут быть отделены с помощью микропипетки и помещены в стерильный сосуд. Для усовершенствования процесса выде- ления было предложено специальное устройство, состоящее из колбы со встроенным рукавом. Схема этого устройства изображена на рис.18.

Рис. 18. Установка для выделения водорослей на основе фототаксиса (An- dersen, Kawachi, 2005): a – флагелляты, обладающие способностью к фото- таксису, засасываются через конец пипетки и затем перемещаются через отверстия в пипетке. Конец пипетки ломается в месте, указанном стрелкой и выбрасывается, а водоросли из пипетки переносят в стерильную питательную среду; b – флагелляты, не способные к фототаксису, концентри- руются с помощью яркого света в узком рукаве колбы (слева) и остаются там после выливания в результате закрывания отверстия рукава стеклян- ным шариком

Образец и стерильные шарики помещаются в колбу, рядом с ко- торой устанавливается источник света. После того, как подвижные клетки водорослей вследствие фототаксиса заплывают в рукав, колба наклоняется так, что шарики закрывают рукав, в то время как остав- шаяся жидкость выливается.

Более сложный метод предполагает использование специально скон- струированной микропипетки, отделяющей флагелляты от других орга- низмов. Часть наконечника пипетки ломается и выбрасывается, а клетки, которые заплывают выше уровня пипетки, попадают затем в специальный сосуд. Некоторые неподвижные клетки водорослей (например, Myxosarci- na) могут двигаться через агар к источнику света. После миграции отдель- ные клетки можно собрать и перенести в сосуд для дальнейшего культиви- рования (Andersen, Kawachi, 2005).