ГЛАВА 6. МЕТОДИКА ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬГОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
Целью методов очистки является получение жизнеспособной куль- туры одного вида, свободной от других видов («загрязнителей» – эукариот, прокариот и вирусов). Идея чистых культур берет свое начало со времен Коха и Пастера относительно бактерий. Для водорослей термин «однови- довой» стал означать культуру водорослей одного вида, и если культура не имела загрязнителей, она стала называться «чистой» или «аксеничной». Термин «гнотобиотик» обычно используется для индивидуумов бoльших по размеру видов, свободных от микроорганизмов или паразитов. В связи с тем, что некоторые водоросли частично или полностью гетеротрофны, имеется необходимость поддерживать жизнеспособность живых или по- гибших культур бактерий, других водорослей, или протист. Такие культу- ры иногда называются биксеничными. Для других культур трудно дать од- нозначное определение (например, для культуры Pinnularia с эндосимбио- тическими бактериями) (Guillard, 2005).
6.1. Основные условия очистки культур
Методы получения аксеничных культур включают все приемы полу- чения чистых культур. В последнее время все шире используется новейшее оборудование, в связи с чем старые методы совершенствуются и сочетают- ся с новыми и эффективными способами очистки.
Общая схема методов изоляции и очистки представлены на рисунках 19 и 20. В методах очистки могут быть использованы все, некоторые, или только несколько операций. Однако обычно одновидовые культуры можно очистить, как это рекомендовал делать Е.Прингшейм (Pringsheim, 1946).
Некоторые способы могут использоваться в особых случаях очистки, которые не показаны на рисунке 19. Они включают использование детер- гентов для разделения клеток и частиц, обработку ультразвуком, переме- шивание, фрагментацию нитей, колоний и талломов некоторых водорос- лей. Эти способы очистки показаны на рисунке 20.
96
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
Полевой образец
Очистка от хищников и мусора
Разделение по размеру (при помощи сита) или по плотности (центрифугированием)
Обогащенная среда (для всех видов водорослей)
Выборочная среда (для определенных видов)
Фильтрация, центрифугирование для выделения водорослей или избавле- ния от примесей пикопланктона и особенно гетеротрофных бактерий
Поточная цитометрия (сортировка клеток)
Агаровые косяки или залитые чаш- ки Петри (+/- ан- тибиотики, УФ, и т.д.)
Изоляция микропипет- ками (+/- ан- тибиотики, УФ, и т.д.)
Многократное разведение в жидкой среде (+/- антибио- тики)
A B C D
Чистая одновидовая культура
Чистая одновидовая безвирусная культура
Рис. 19. Последовательность очистки и изоляции одноклеточных водорослей (Guillard, Morton, 2003)
97
I Полевой
образец
Налеты водорослей, корки из водорослей, кора, камни, древесина, колонии водорослей, эпифиты детрит.
II
Основная очистка
Выделение водорослей с помощью щипцов, игл, бритвы, захват колоний.
III
Разрушение для лучшей очистки
Встряхивание, размешивание, обработка ультразву- ком, детергентами (часто в комбинации с шагом IV)
IV
В соответствии с клеточной массой и плотностью: осаждение, центрифугирование, послойное цен- трифугирование, центрифугирование по градиенту плотности. В соответствии с размерами: выборочное по раз- меру фильтрование (для крупных водорослей), мембранное фильтрование (для мелких).
V
Концентриро- вание водо- рослей
Отделение еди- ничных нитей или клеток (шаг VI на рис.19)
Рис.20. Последовательность очистки и изоляции колониальных водорослей (Guillard, Morton, 2003)
В практике методов получения альгологически чистых культур во- дорослей существует два противоположных способа очистки. Один способ (открытый способ) подразумевает физическое разделение нужных орга- низмов от нежелательных загрязнителей в несколько этапов. Другой спо- соб направлен на уничтожение контаминантов (закрытый способ). Если существует несколько загрязнителей, может понадобиться несколько эта- пов очистки с использованием различных методов для успешного уничто- жения нежелательных объектов. Это также необходимо, если контаминант имеет несколько стадий жизненного цикла в культуре. Выделение орга- низма в одновидовую или аксеничную культуру должно рассматриваться сугубо индивидуально применительно к данному моменту. Например, со- бираясь на охоту, рыбалку или пикник, надо выбирать подходящее данно- му случаю необходимое оборудование и снаряжение. Так и в эксперимен- те, не существует единой универсальной методики для всех ситуаций, по- этому в каждом случае нужно искать особые подходы к очистке.
