Глава 4 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ.
Процесс выращивания микроводорослей в питомнике,
созданным на базе ИнБЮМ НАН Украины, включает:
• подготовку питательных сред;
• хранение коллекции кормовых водорослей (маточные
культуры);
• подготовку инокуляционного материала (стартовые
культуры);
• массовое культивирование микроводорослей.
Основные этапы культивирования микроводорослей
представлены на схеме (рис. 96).
Рис. 96. Схема процесса производства микроводорослей.
4.1. Подготовка питательных сред
Процесс интенсивного культивирования микроводорослей
зависит от качества морской воды, используемой для приготовления
питательной среды. Существует ряд способов обработки морской
воды при выращивании одноклеточных водорослей:
1. фильтрация через мембранные фильтры с диаметром
пор 0,45 или 0,22 мкм;
2. стерилизация при температуре 65 - 75ºС;
3. автоклавирование;
4. химическая обработка гипохлоритом натрия (NaOCl).
Фильтрация морской воды через мембранные фильтры с
последующей ультрафиолетовой стерилизацией и химическая
обработка воды применяются в крупных промышленных
питомниках.
Для ультрафиолетовой стерилизация морской воды
используются специальные ультрафиолетовые лампы,
смонтированные в жестком корпусе, внутри которого протекает вода,
которая подвергается воздействию ультрафиолетового излучения
(рис. 97).
Рис. 97. Внешний вид ультрафиолетовой лампы.
Вода поступает через нижний патрубок ультрафиолетовой ре-
акционной камеры и протекает вокруг мощной ртутной лампы,
термически защищенной кварцевой трубкой. Длина волны излучения
ультрафиолетовой лампы 253 нм. Излучение разрушает молекулы
ДНК в клетках бактерий и микроорганизмов, препятствуя их
размножению. Выходящая через верхний патрубок вода
стерилизована и готова к использованию.
Для химической стерилизации воды используется гипохлорит
натрия, который добавляют в морскую воду из расчёта 20-50 мг/л.
Химическая стерилизация продолжается не мене 1 часа в
зависимости от объема культиватора, после чего проводится
нейтрализация хлора с помощью бикарбоната натрия или
тиосульфата натрия, с целью восстановления рН среды до 7,8-8,2.
Автоклавирование или влажная стерилизация паром обычно
используется при культивировании микроводорослей в небольших
объемах (5-6 л) и определяется размером автоклава, так как морская
вода стерилизуется вместе с колбами. Автоклавирование происходит
при температуре 120ºС под давлением 2 атмосферы, в течение 30
минут.
Опыт нашей работы показал, что в небольших питомниках
питательные среды целесообразнее готовить на фильтрованной и
стерилизованной морской воде, что позволяет исключить заражение
культур микроорганизмами. При очистке морская вода проходит
через 4 фильтрующих элемента (фильтры – картриджи) с диаметром
пор 20, 10, 5 и 1 микрон, после чего вода стерилизуется при
температуре 75ºС и обогащается питательными веществами (рис. 98).
При приготовлении питательной среды для коллекционных
культур, вода трижды стерилизуется при температуре 75ºС с
интервалом в один день.
Водоросли хорошо растут на питательной среде обогащенной
макро- и микроэлементами, которые вносят в морскую воду. К
макроэлементам относятся азот, фосфор, калий. К микроэлементам –
железо, марганец, медь, цинк, кобальт, бор, молибден. Источниками
азота для водорослей могут быть азотнокислый калий или натрий,
мочевина; источниками фосфора – одно- или двузамещенный
фосфорнокислый калий или натрий, аммофос. Очень важно, чтобы в
питательной среде наряду с натрием содержался калий, так как он
ускоряет рост водорослей. При его отсутствии или недостаточном
количестве рост микроводорослей тормозится.
Рис. 98. Установка для фильтрации морской воды.
При хранении водорослей на жидких средах следует
использовать среду Гольдберга в модификации Кабановой или среду
Конвея. При культивировании микроводорослей в 2-5-литровых
колбах или полиэтиленовых мешках мы используем среду Guillard
F/2 или среду Конвея.
Состав среды Гольберга в модификации Кабановой.
Раствор 1 Раствор 2
КNO3 - 20,2 г; FeSO4 ⋅ 4 H2O - 28 мг;
NaH2 HPO4 ⋅ 2H2O - 0,710 г; FeCl3 ⋅ 6 H2O - 27,03 мг;
H2O дистиллированная - 100мл. CoCl2 - 23,8 мг;
Na2ЭДТА - 300 мг;
H2O дист. - 100 мл.
Рабочий раствор: раствор 1 - 1мл;
раствор 2 - 1 мл;
цистин - 5 мг;
Na2S2O3 - 1,2 мг.
315
Состав среды Конвея (в собственной модификации).
NaNO3 - 200,0 г ; MnCl2 ⋅ 4 H2O - 0,72 г;
NaH2HPO4 ⋅ 2H2O - 40,0 г; FeCl3 ⋅ 6 H2O - 5,20 г;
H3BO3 - 67, 2 г; ЭДТА (трилон Б) 90,0 г;
Раствор микроэлементов - 2 мл;
H2O дистиллированная - 2 л.
Раствор микроэлементов:
ZnCl2 - 2,1 г ; CuSO4 ⋅ 5 H2O - 2 г;
CoCl2 - 2,0 г; H2O дист. - 100 г;
(NH4) 6 Mo7O24 ⋅ 4 H2O - 0,9 г;
Рабочий раствор: 1 мл/1л морской воды.
Состав среды Guillard F/2.
NaNO3 - 75 г/л;
NaH2HPO4 ⋅ 2H2O - 5 г /л;
Na2 SiO3 ⋅ 9H2O - 30 г /л.
Следы металлов:
FeCl3 ⋅ 6 H2O - 3,50 г;
Na2ЭДТА - 4,36 г.
Растворить в 900 мл дистиллированной воды.
Раствор микроэлементов - 1мл.
Раствор микроэлементов:
CuSO4 ⋅ 5 H2O - 0,98 г/100мл ;
Zn SO4 ⋅ 7 H2O - 2,20 г/100мл;
CoCl2 ⋅ 6 H2O - 1,00 г/100мл ;
MnCl2 ⋅ 4 H2O - 18,00 г/100мл;
Na2 MoO4 ⋅ 2 H2O - 0,63 г/100мл.
Витамины:
В1 - 1 мг;
В12 - 1 мг;
В6 - 20 мг.
Витамины растворить в 1 л дистиллированной воды; отобрать 0,5
мл раствора витаминов и добавить к 1 л стерильной морской воды.
Рабочий раствор: 1 мл среды на 1 л морской воды.
316
Потребность микроводорослей в микро- и макроэлементах
различна, поэтому при выращивании очень важно правильно
подобрать питательную среду, благодаря которой можно получать
максимальные биомассы. Например, при культивировании
диатомовой водоросли Скелетонема важно, чтобы в состав
питательной среды входил кремний, необходимый для развития
клеточной оболочки. Поэтому нами используется питательная среда
Guillard F/2, содержащая соли кремния.
Удельная скорость роста водоросли на среде F/2 на порядок
выше, чем на среде Конвея (без кремния), и составляла
соответственно 0,87 и 0,06 сут-1 (рис. 99).
Рис. 99. Рост микроводоросли Sceletonema costatum на разных питательных средах.
Максимальная концентрация клеток кудьтуры скелетонемы,
выращиваемой на среде F/2 составляла 7,42 млн. кл/мл и 4,11 млн.
кл/мл - на среде Конвея, а среднесуточный прирост соответственно:
1,72 и 1,34 млн. кл/мл.·сут.
