4.4. Массовое культивирование водорослей

Развитие промышленного производства биомассы водорослей
сопровождалось разработкой новых конструкций культиваторов, в
которых происходит наращивание микроводорослей до высоких
321
концентраций. В зависимости от потребности питомника в корме,
культивирование водорослей может осуществляться в культиваторах
разного типа: сферические плоскодонные стеклянные колбы или
оплетенные бутыли (V=20 л), полиэтиленовые мешки,
полиэтиленовые баки в стальной оплетке (V до 100 л). Крупные
коммерческие питомники наращивают большие биомассы
микроводорослей, поэтому объём культиваторов увеличивается до
480 л, и, как правило, они имеют цилиндрическую форму и
изготовлены из прозрачного пластика, например полиэтилена. Для
поддержания прочности таких культиваторов используют стальной
каркас. Осветительные лампы устанавливаются внутри культиватора,
что обеспечивает получение больших биомасс водорослей (рис.102).
Функционирование таких культиваторов возможно только при
наличии поршневых или центробежных насосов. Однако
крупномасштабные культиваторы имеют некоторые неудобства. При
наращивании больших биомасс микроводорослей необходимо
интенсивное перемешивание, для обеспечения равномерного питания
водорослей, а это приводит к частичному разрушению клеток у
большинства видов водорослей. Кроме этого, стенки культиваторов
обрастают водорослями, поэтому после каждого цикла выращивания
их необходимо очищать химическим способом.
Для питомника ИнБЮМ, рассчитанного на получение 100 тыс.
экз. спата устриц, использование таких культиваторов
нерентабельно. Поэтому в качестве рабочих культиваторов
используются одноразовые полиэтиленовые мешки объемом 20 л
(рис.103).
Их изготавливают из полиэтиленового рукава, основание
которого запаивают. Мешки устанавливают по обе стороны световой
решетки из люминесцентных ламп ЛД – 40, расположенных
горизонтально.
Мешки используются одноразово, так как к внутренней
поверхности могут прикрепляться отмершие клетки водорослей и
вызывать бактериальное заражение культур.
Они удобны в эксплуатации и отвечают требованиям,
предъявляемым к культиваторам закрытого типа.

Рис.102. Внешний вид культиваторов, используемых в крупномасштабных
питомниках: А - полиэтиленовые мешки на 480 л, поддерживаемые стойками, при
естественном освещении; В – мешки объёмом 80 л, подвешены вокруг центральной
оси с помощью потолочной вращательной системы. Флуоресцентные лампы,
расположенные сверху по центру; С - полиэтиленовые мешки, поддерживаемые
пластиковым каркасом, расположенные по обе стороны от осветительной установки;
D - цилиндры объёмом 100 л, изготовленные из стекловолокна и установлены вдоль
вертикально расположенных люминесцентных ламп; Е - цилиндры из стекловолокна
высотой 2,4 м и диаметром 0,3 м с наружным освещением люминесцентными
лампами длиной 2,4 м, установленными вертикально.

Рис. 103. Массовое культивирование микроводорослей в питомнике ИнБЮМ.
Массовое культивирование микроводорослей в ИнБЮМ
производится на стерильной морской воде, обогащённой
питательной средой Конвея или средой Guillard F/2. Схема процесса
выращивания водорослей при массовом культивировании
представлена на рис. 104.
Культиваторы на 1/3 заполняли питательной средой, вносили
инокулят в объёме 4 – 6 л, а затем добавляли оставшуюся морскую
воду с питательной средой. Мешки устанавливали перед панелью из
люминесцентных ламп ЛД-40, расположенных горизонтально.
Максимальная интенсивность освещения составляла 10 тыс. люкс.
Выращивание водорослей осуществляли при температуре 22 – 24ºС и
круглосуточной аэрации газовоздушной смесью, содержащей 2%
СО2.
При таких оптимальных условиях выращивания, через 12-14
дней, биомасса водорослей увеличивалась в 2-4 раза по сравнению с
изначальной.

Рис. 104. Схема подготовки питательной среды и массового культивирования
микроводорослей.

Рост микроводорослей при массовом культивировании
описывается S - образной кривой (рис.105).

Рис. 105. Динамика роста микроводоросли Isochrysis galbana.
Рассмотрим динамику роста микроводорослей на примере
изохризис. В процессе выращивания водорослей различают
следующие фазы роста:
1) лаг-фаза, когда не происходит увеличения количества клеток
- период акклиматизации водорослей (первые 2-3 дня
выращивания). Продолжительность лаг-фазы зависит от
концентрации клеток в инокуляте. Если используется малое
количество клеток, то в свежей питательной среде лаг-фаза
наблюдается, а при больших количествах клеток в инокуляте
– она не отмечается;
2) экспоненциальная или логарифмическая фаза роста, когда
численность клеток увеличивается в геометрической
прогрессии. После того как водоросли приспособились к
условиям культивирования, их клетки увеличиваются в
размере и начинают активно делиться, вследствие чего
численность увеличивается по экспоненте (например, 8, 16,
32, 64 … и т.д.). Продолжительность этой фазы зависит от
стационарная
логарифмическая
лаг-
фаза
326
скорости деления и величины максимальной концентрации
клеток, при которой способен расти данный вид. Чем
медленнее размножаются водоросли, тем продолжительнее
будет экспоненциальная фаза роста;
3) фаза уменьшения относительного роста (фаза замедления
роста);
4) стационарная фаза роста, когда количество клеток
постоянно. Культура достигает максимальной плотности.
Деление клеток прекращается, их численность не
увеличивается, так как происходит снижение концентрации
биогенных элементов в питательной среде в результате их
использования одноклеточными водорослями и уменьшается
количество света, проходящего через плотную культуру.
Микроводоросли собранные на стационарной фазе роста
являются высококачественным кормом для двустворчатых
моллюсков.
Режим культивирования водорослей.
Культивирование микроводорослей можно осуществлять в двух
режимах: накопительном (периодическая культура) и непрерывном
(полупроточная культура). Накопительный режим культивирования
предусматривает накопление биомассы водорослей до тех пор, пока
не будут израсходованы все биогены и не прекратится рост
микроводорослей. Полупроточное культивирование характеризуется
непрерывным ростом водорослей и сочетается с периодическим
изъятием определенной части урожая и внесением в культуру свежей
питательной среды.
Накопительное культивирование.
Накопительный способ культивирования микроводорослей
применяется при выращивании корма для личинок мидий и устриц,
находящихся на поздних стадиях развития или при подращивании
спата. При культивировании водорослей в данном режиме в
культиватор, заполненный питательной средой, вносят небольшое
количество инокулята. Начальная концентрация водорослей
составляет 4,07·106, 0,55·106, 0,55·106 и 0,1·106 кл/мл соответственно
для I. galbana, D. viridis, T. suecica и C. сalcitrans. В процессе роста
микроводорослей происходит увеличение концентрации клеток до
некоторой максимальной плотности, соответственно 15,25·106;
327
3,92·106; 3,5·106 и 0,64·106 кл/мл для I.galbana, D. viridis, T. suecica и
C. сalcitrans (табл.34).


Накопление биомассы продолжается до тех пор, пока не будут
потреблены все биогены, показателем чего является снижение
скорости роста водорослей. Накопление биомассы водорослей
представлено на рис. 106.
В зависимости от условий культивирования в накопительном
режиме, количество фаз роста может изменяться. Лаг-период
занимает очень короткий промежуток времени, поскольку культура
была уже адаптирована к условиям выращивания. При
культивировании кормовых видов водорослей главной задачей
является получение биомассы нужного биохимического состава за
короткий промежуток времени, поэтому наибольший интерес
представляют три фазы роста: логарифмическая, замедления роста и
начало стационарной фазы. В логарифмической фазе роста
практически всегда можно выделить участок линейного роста,
характеризующийся постоянством скорости роста (продуктивность
328
культуры постоянна). Рост водорослей на этом участке практически
неограничен минеральными компонентами. Биохимический состав
водорослей на этой фазе роста характеризуется максимальным
содержанием белка, необходимого личинкам на ранних стадиях
развития.

Рис. 106. Динамика биомассы водорослей в накопительных культурах при
выращивании в полиэтиленовых мешках: 1 - Tetraselmis suecica, 2 - Dunaliella viridis,
3 – Isochrysis galbana, 4 – Chaetoceros calcitrans.
В фазе замедления скорость роста водорослей уменьшалась в 1,5
– 2 раза по сравнению с линейной фазой, вследствие снижения
концентрации биогенов. В конце фазы скорость роста снижалась до
нуля, а биохимический состав водорослей характеризовался
накоплением углеводов.
В качестве ростовых характеристик водорослей при
накопительном режиме культивирования можно выбрать удельную
скорость роста и продуктивность, которые изменялись в
зависимости от фазы роста (табл. 35).
329


Максимальные значения удельной скорости роста отмечены в
логарифмической фазе роста, а минимальные – в стационарной.
Продуктивность также снижалась с возрастом водорослей. Так, в
логарифмической фазе роста продуктивность водорослей составляла
47,99; 113,35; 89,67 и 3,49 г ·л-1 · сут-1, соответственно у I. galbana,
T. suecica, D. viridis и C. calcitrans. В стационарной фазе роста
продуктивность снизилась на порядок у I. galbana и в 3 - 8 раз - у C.
calcitrans, T. suecica и D. viridis. В стационарной фазе роста
прекращается деление клеток, поэтому удельная скорость роста и
продуктивность минимальны, вследствие чего наблюдается
изменение биохимического состава водорослей. В клетках
накапливалось максимальное количество липидов и жирных кислот,
необходимых для роста личинок на поздних стадиях развития и
успешного прохождения метаморфоза, а также для дальнейшего
роста спата. Поэтому сбор биомассы водорослей в накопительном
режиме культивирования целесообразно производить в конце
стационарной фазы роста.
Накопительный способ культивирования считается самым
легким и надежным для получения максимальных биомасс
водорослей при условии строгого соблюдения стерильности
выращивания.
330
Полупроточное культивирование.
Полупроточный метод выращивания микроводорослей позволяет
достаточно быстро достигнуть состояния динамического равновесия
роста культуры; стабилизировать параметры среды и получить
устойчивую величину биомассы с заданным биохимическим
составом. При таком режиме культивирования водорослей клетки
быстро адаптируются к условиям среды (постоянная интенсивность
света и температура), вследствие чего результаты не зависят от
исходной концентрации культуры. Данный режим культивирования
позволяет задавать такую плотность культуры, при которой
водоросли в течение длительного периода находятся в фазе
логарифмического роста, характеризующейся максимальным
содержанием белка в клетках. Полупроточное культивирование даёт
возможность нарастить большие количества одноклеточных
водорослей. Главный недостаток данного способа культивирования –
риск загрязнения другими микроводорослями или
микроорганизмами (бактериями, инфузориями), вследствие
длительного периода выращивания в одном культиваторе (от 1 до 3-
х месяцев).
Фаза линейного роста при полупроточном культивировании у
разных кормовых видов водорослей, протекает неравномерно. Так, у
T. suecica и D. viridis она длится с 4 по 9-й день, а у I. galbana и Р.
tricornutum с 3 по 8-й день культивирования. Максимальная
продуктивность водорослей составляла соответственно 113,35; 89,67
и 47,99 г ·л-1 · сут-1 у T. suecica, D. viridis, I. galbana.
Управлять ростом водорослей при полупроточном
культивировании можно путём разбавление культуры. Плотность
культуры может изменяться в зависимости от объёма разбавления и
частоты внесения питательной среды.
Величину биомассы, которую можно постоянно изымать,
определяли с учетом величины продуктивности водорослей в
логарифмической фазе (линейный участок) по накопительной кривой
роста исследованных видов водорослей (см. рис.106).
Культуры водорослей начинали разбавлять в конце
логарифмической фазы роста, на 9-й день для T. suecica и D. viridis
и 8-й день - для I. galbana и Р. tricornutum (рис. 107).

Рис. 107. Динамика плотности полупроточных культур микроводорослей со
скоростью протока 0,18 сут-1: 1- Phaeodactylum tricornutum, 2 - Isochrysis galbana, 3 -
Tetraselmis suecica, 4 - Dunaliella viridis.
При скорости протока 0,18 сут-1 (т.е. ежедневном сливе 3 л
водорослей) было отмечено снижение плотности культур с 9, 87 до
8,35 млн. кл/ мл - у I. galbana, с 16,52 до 12,9 млн. кл/мл - у Р.
tricornutum, с 2,31 до 1,76 млн.кл/мл - у T. suecica и с 2,19 до 1,62
млн.кл/мл - у D. viridis с последующим возвращением за сутки к
исходному уровню плотности.
Из культиваторов объёмом 18 л при таком режиме
культивирования можно ежедневно изымать: 460 мг сухой биомассы
I. galbana, 420 мг - Р. tricornutum, 1368 мг - T. suecica и 1456 мг - D.
viridis. Полученные расчеты позволяют определить величину
биомассы каждого вида водорослей, необходимую для всего периода
выращивания личинок и молоди моллюсков в питомнике. Поэтому,
используя основные характеристики водорослей (высокая скорость
роста, способность расти и размножаться при больших плотностях),
изменяя удельную скорость протока и время включения протока,
можно прогнозировать количество изымаемой биомассы, на весь
цикл выращивания личинок в питомнике.
332
При выращивании личинок и спата мидий и устриц в питомнике
нами используются как накопительный, так и полупроточный режим
культивирования микроводорослей. Эти методы позволяют
наращивать биомассы водорослей с максимальным содержанием
белка, углеводов, липидов и использовать водоросли в качестве
корма в разные периоды выращивания личинок и спата мидий и
устриц.
Контроль за ростом микроводорослей.
В процессе роста микроводорослей необходимо определять их
плотность (концентрацию). Существует ряд методов определения
плотности культуры: использование специальных камер для подсчета
концентрации клеток, а также определение плотности на
спектрофотометре или флюориметре.
Концентрацию клеток в культурах можно определять прямым
подсчетом в камере Горяева под микроскопом МБИ -6 (рис. 108).

Рис. 108. Счетная камера Горяева, сетка, с помощью которой проводится
подсчет клеток водорослей.
Камера представляет собой стеклянную пластинку с отделенной
средней частью с помощью поперечных желобков. На поверхности
средней части пластинки нанесена сетка в виде квадратов с
333
известной площадью. Объем камеры, состоящей из 25 квадратов,
составляет 0,0001мл.
Каплю культуры наносят на сетку и покрывают покровным
стеклом. Покровное стекло тщательно притирают. Просчитывают
число клеток в 25 квадратах; полученную сумму умножают на 104 и
получают число клеток в 1 мл суспензии. Если плотность культуры
большая, суспензию необходимо развести в 10, 20 раз, для того,
чтобы подсчет числа клеток был более точным и выполнить
поправку на разведение. Например: если в 25 квадратах было 150
клеток, и суспензия разведена в 20 раз, концентрация клеток в 1мл
суспензии составит 150 · 104 · 20 = 30 · 106 кл/мл. Для более точного
определения плотности культуры, подсчет клеток необходимо
произвести в трех повторностях и найти среднее значение.
Если клетки микроводорослей подвижные, то перед подсчетом
плотности культуры их необходимо обездвижить спиртом или
слабым раствором уксусной кислоты.
При определении плотности культуры спектрофотометрическим
методом проводят калибровку фотоэлектроколориметра (ФЭК) и
составляют градуировочную кривую для каждого вида водорослей и
затем, по этим кривым, определяют число клеток. Градуировочную
кривую составляют следующим образом:
•
делают ряд последовательных разведений суспензии
микроводорослей;
•
проводят измерения оптической плотности
культур на ФЭК при длине 750 нм;
•
параллельно с измерением на ФЭК подсчитывают
измеряемые плотности в камере Горяева;
•
на основании полученных данных строят калибровочную
кривую.
Факторы среды, влияющие на рост одноклеточных водорослей.
При массовом культивировании микроводорослей главными
факторами, влияющими на рост культур, являются: свет,
температура, углеродное и минеральное питание. Обнаруженные
взаимосвязи показаны на рисунке 109.
Физические условия существования могут быть не только
лимитирующими, но и регулирующими факторами, благотворно
влияющими на химические свойства водорослей. Для получения
334
высокой продуктивности культуры существенное значение имеет не
столько зависимость роста и фотосинтеза водорослей от каждого из
этих факторов в отдельности, сколько их сопряженное действие.

Рис. 109. Схема взаимосвязи факторов, влияющих на продуктивность
водорослей.
Освещенность.
Свет является одним из главных экологических факторов,
влияющих на физиологическое состояние микроводорослей. С одной
стороны, свет определяет рост клеток, развитие и интенсивность
фотосинтеза в клетках водорослей, с другой, свет высокой
интенсивности может вызывать фотоокислительный стресс, который
приводит к фотоингибированию, деструкции фотосинтетических
пигментов и гибели клеток. При массовом культивировании
микроводорослей оптимальный диапазон освещенности: 2500-10000
люкс. Источником света служат люминесцентные лампы дневного
света ЛД-40. Число люминесцентных ламп определяется высотой и
диаметром культиваторов. Поэтому для колб, объёмом 2 л,
достаточно 4-х ламп мощностью по 40W, а для полиэтиленовых
мешков - необходимо не менее 8-10 ламп. При выращивании
Концентрация
элементов
минеральн.
питания
Углекислый
газ
рН
Температура Интенсивность
света
335
стартовых культур освещенность на поверхности культиватора
должна быть 5-6 клк, а для получения высокой плотности культур -
освещенность увеличивают до - 10-20 клк (массовое
культивирование).
Кроме интенсивности света большое значение для культуры
водорослей имеет продолжительность светового дня. Минимальная
длина светового дня при выращивании микроводорослей – 12 ч; при
ее увеличении до 24 часов плотность культур увеличивается вдвое,
поэтому массовое культивирование водорослей осуществляется при
круглосуточном освещении.
Углеродное питание.
Для роста микроводорослей, помимо элементов минерального
питания, необходимо углеродное питание. Энергичное пропускание
воздуха с достаточно высоким содержанием углекислоты –
необходимое условие для успешного культивирования водорослей.
Источником углекислоты служит углекислый газ из баллонов,
который предварительно смешивают с воздухом (рис. 110).

Рис. 110. Схема смешивания СО2 и воздуха.
Через культуральную жидкость круглосуточно пропускали
газовоздушную смесь, содержащую около 2% СО2. Смешивание
углекислого газа и воздуха осуществляли в сосуде с раствором
КМnO4 (V = 10 л) в соотношении 2:100 (2 пузырька СО2 и 100
воздух СО2
р-р КМnO4
336
пузырьков воздуха. Через 4-5 час. рН культуральной среды
находился в пределах 7,5 - 8,2 .
Культивирование микроводорослей с добавлением угекислого
газа позволяет за короткий срок получить максимальную биомассу.
Так, при культивировании изохризиса и дуналиеллы с продувкой
воздухом, максимальные концентрации водорослей составили
соответственно 11,57 и 1,9 млн. кл/мл (рис. 111).
При аэрации газовоздушной смесью, содержащей 2% СО2,
обеспечивающей оптимальный уровень рН среды (7,5 - 8,2),
максимальные концентрации изохризиса и дуналиеллы увеличились
соответственно до 14,58 и 2,96 млн. кл/мл. Максимальные биомассы
- 571,4 мг/л и 926,5 мг/л соответственно для изохризиса и


дуналиеллы получали за 7 дней при добавлении 2% углекислого газа,
и за 14-15 дней - при выращивании без углекислого газа. Увеличение
концентрации углекислого газа свыше 2% приводит к изменению pH
среды и, способствует более длительному периоду выхода на
стационарную фазу роста, и соответственно снижению
продуктивности водорослей. Однако, если биомасса водорослей
высокая (3–5 г/л сухого веса), то содержание углекислого газа
необходимо увеличить до 5%.
Температура.
Оптимальная температура культивирования кормовых видов
микроводорослей - 20-24ºС. При температуре ниже, чем 16ºС и выше,
чем 27ºС их темп роста замедляется, а при температуре 30ºС -
водоросли погибают. Так, при температуре 24ºС скорость роста I.
galbana и D. viridis в 2-3 раза выше, чем при температуре 15ºС.
Обратная тенденция прослежена для диатомовых водорослей: P.
tricornutum, C. calcitrans. Их скорость роста при температуре 15ºС в
2 раза выше, чем при 24ºС. Поэтому оптимальная температура
культивирования золотистых и зеленых микроводорослей - 24ºС, а
диатомовых - не выше 20ºС. При низких значениях температуры (8-
14ºС) поддерживается только жизнедеятельность коллекционных
культур.