9.3. Коловратки. Культивирование коловраток.
Из различных видов зоопланктона наиболее распространенным кормом для личинок многих видов морских рыб и некоторых беспозвоночных является солоноватоводная коловратка Brachionus plicatilis Muller. Небольшой размер (100….300 мкм) и относительно мягкие покровы делают ее подходящим кормом для личинок с малым раскрытием рта в первые недели жизни.
Химический состав коловраток очень лабилен: его изменение происходит в течение нескольких часов в зависимости от качества корма, что открывает большие возможности для направленного формирования химического состава коловраток, соответствующего потребностям гидробионтов, питающихся коловратками.
Как объекты культивирования коловратки достаточно технологичны: они очень пластичны в отношении условий окружающей среды ( концентрация и химический состав солей, температура, освещенность, pH, плотности популяции (более 1000 экз/мл).
Коловратки – мелкие водные беспозвоночные, относящиеся к типу первичнополостных червей, классу – коловраток, размерами от 40 мкм до 2 мм, преимущественно обитатели пресных вод, некоторые живут и в морских водах. Название класса происходит от присутствующего на головном отделе коловращательного аппарата, с помощью которого они передвигаются.
Коловратка - Brachionus plicatilis O.F. Muller, 1786, используемая для кормления личинок морских рыб, приобрела значение наиболее употребляемого живого корма для питания личинок малого размера [47]. Br. plicatilis принадлежит к гетерогонному виду. Общепринятая схема гетерогонии (чередование партеногенетического и двухполого размножения) и предполагает участие в размножении двух категорий самок – миктических и амиктических [1]. Самки имеют размеры от 100 до 400 мкм, самцы - 20-40 мкм, ювинильные особи – 10-80 мкм. Амиктические самки не способны к оплодотворению, они производят и вынашивают диплоидные (2N) амиктические яйца, из которых выклевываются либо амиктические самки, (в зависимости от условий), либо миктические самки, способные к однополому или двуполому размножению. В первом случае самки вынашивают гаплоидные (N) миктические яйца, из которых развиваются самцы. В случае оплодотворения миктической самки откладываются диплоидные покоящиеся яйца, из которых после латентного периода появляются амиктические самки. Миктические и амиктические самки, присутствующие в культуре, внешне различаются по наличию определенного типа яиц. При смешанном размножении в популяции коловраток имеются самцы и самки всех категорий: ювинильные, амиктические, миктические оплодотворенные с покоящимися яйцами и неоплодотворенные, а также самки в пострепродуктивном периоде – сенильные (Рис. .5). Наличие разных стадий жизненного цикла и их соотношений характеризует состояние культуры коловраток. Высокий темп размножения амиктических самок, дающих партеногенетические поколения, позволяет популяции достигать больших плотностей. Миктические самки,
откладывающие покоящиеся яйца, обеспечивают сохранность вида в неблагоприятных условиях среды .
Рис. 5. Коловратки Brachionus plicatilis: А - самка с покоящимися яйцами; Б - самка с амиктическими яйцами; В - самка с миктическими яйцами, из которых развиваются самцы; Г- самка с мелким амиктическим яйцом: 1- панцирь; 2 - основание ноги; 3 - коловращательный аппарат; 4- мастакс (челюстной аппарат); 5 - желудочек; 6 - кишечник; 7- созревающий фолликул При культивировании следует избегать условий, при которых доминируют миктические самки, поскольку их покоящиеся яйца имеют латентный период. Амиктические самки с партеногенетическими яйцами составляют основу здоровой, быстро размножающейся популяции коловраток. Переход к двуполому размножению является признаком неблагополучия в культуре, при этом доля миктических самок превышает 10%. Миктические яйца на самцов и амиктические не имеют длительной покоящейся стадии, и молодь в зависимости от температуры может появиться через несколько часов или дней .
Необходимость в аквакультуре коловраток возникла с развитием искусственного воспроизводства рыб. Тогда же появилась потребность в получении длительно «вегетирующей» культуры коловраток, как естественного стартового пищевого корма. Коловратки, как известно, являются полноценной пищей для личинок рыб в первые дни их активного питания, что способствует быстрейшему формированию ферментативной системы и повышению их жизнестойкости .
Пищевая ценность коловраток и способы ее улучшения. Объем информации о культивировании коловратки для личинок морских рыб огромен. Коловратку культивируют как в лабораторных, так и в промышленных условиях. Наиболее важные исследования проведены учеными Японии.
Массовое культивирование коловраток вначале проводили, используя в качестве кормового организма только микроводоросли. В 70 гг. для выращивания коловраток стали применять хлебные дрожжи (Sacharomyces cereviseae или S. elipsoides). С использованием хлебных дрожжей плотность культуры коловраток возросла в десятки раз, по сравнению с той, что отмечалась при содержании их на микроводорослях. Этим добились сокращения трофической цепи и повысили экономическую эффективность выращивания живых кормов. Однако коловратки, культивируемые на дрожжах, часто являлись причиной высокой смертности личинок рыб. Было установлено, что высокую смертность личинок рыб можно предупредить, если культивировать коловраток совместно на дрожжах и морских микроводорослях, или сначала на дрожжах, а затем на микроводорослях.
Наиболее поразительные и существенные различия оказались в содержании ВНЖК в коловратках в зависимости от их корма. Коловратки, культивированные с дрожжами, имели очень низкий уровень ω3 высоконенасыщенных жирных кислот (ВНЖК ω3) таких как 20:5, 22:6ω3 и высокий - высокомоноеновых жирных кислот, таких как 16:1 и 18:1ω3. Они же, культивированные с морской хлореллой, содержали большое количество 20:5ω3, которая является одной из незаменимых ВНЖК для морских рыб. Эти результаты могут объяснить, почему коловратки, культивируемые с дрожжами всегда более низкого качества, чем при культивировании с морской хлореллой в отношении их пищевой ценности, как живого корма.
Исследования взаимосвязи пищевой ценности живых кормов и используемых кормовых организмов показали, что содержание в живых кормах ВНЖК ω3, таких как 20:5ω3 и 22:6ω3, является основным фактором их пищевой ценности. Основываясь на этих результатах, был выведен новый вид дрожжей, названный ω– дрожжами. Новый сорт дрожжей был получен путем добавления рыбьего жира и жира печени каракатицы в среду культивирования хлебных дрожжей. Живые корма культивируемые на ω-дрожжах имели даже лучшую пищевую ценность, чем выращиваемые на морских микроводорослях.
Если в систему вводились ω – дрожжи или гомогенизированные эфиры ВНЖК ω3, то пищевая ценность полученной коловратки, позволяла с успехом применять ее для выращивания личинок морских рыб. Так появилась возможность культивирования коловраток с использованием искусственно составленной пищи, с неизменно высокой пищевой ценностью и уменьшить стоимость продукции. С этой же целью был разработан метод инкапсулирования. При этом методе коловраток культивируют с использованием искусственного корма в виде микрочастиц, капсулированных в белковую оболочку с нейлоновой сшивкой.
Было доказано, что коловратки легко ассимилируют ВНЖК ω3 и жирорастворимые витамины из кормовых организмов. Используя разные методы, оказались возможным повысить пищевую ценность живых кормов путем ассимиляции ими из культуральной среды не только высоконенасыщенных жирных кислот ω3, но и жирорастворимых витаминов вместе с липидами. Все выше перечисленные методы (прямой, косвенный, единой пищевой цепи, инкапсулирования) успешно применяются в Японии для повышения пищевой ценности любого зоопланктона при выращивании морских рыб.
Таким образом, коловратка Brachionus plicatilis является одним их наиболее распространенных живых стартовых кормов в марикультуре. Интенсификация развития аквакультуры в мире и появление рыбных ферм в Китае, Японии, Средиземноморье стало возможным после усовершенствования технологии культивирования данного вида. Современные стартовые корма на основе коловраток представляют собой культуру этих первичнополостных животных, обогащенных липидами и витаминами, поэтому они пользуются большим спросом. Однако при их производстве все еще существует много проблем, связанных как с гигиеническим состоянием культуры (опасность развития патогенной микрофлоры), так и пищевой ценностью, что отражается на жизнеспособности личинок рыб. Поэтому технология культивирования коловраток в промышленных масштабах все ещѐ требует улучшений и дальнейшего совершенствования, в частности, с привлечением достижений микробиологии и биохимии
Методы и способы культивирования коловраток. Массовое культивирование коловраток может осуществляться несколькими методами. Один из них - непрерывный метод, использовавшегося при культивировании микроорганизмов. Для непрерывных культур характерно постоянство объема среды, а также постоянная подача корма, отвод продукции и метаболитов. Существует два способа ведения непрерывного культивирования – хемостат и турбидостат. Кроме того, отмечают такой способ, как квазинепрерывный, который заключается в импульсных подаче и сливе очень малых доз питательной и культуральных сред. Однако многие считают его промежуточным между накопительным и непрерывным, или – разновидностью непрерывного. Кроме рассмотренных методов выделяют экстенсивные и интенсивные способы выращивания коловраток.
Бакаевой составлена классификация методов культивирования коловраток, используемых в гидробиологии. Изменение плотности культур во времени при использовании различных методов культивирования представлено на рисунке (рис. 6).
Рис. 6. Изменение плотности культуры организмов (Х) во времени (t) при различных методах культивирования [45]: a – периодический (1 – лаг-фаза; 2 – фаза экспоненциального роста; 3 – фаза замедления роста; 4 – стационарная фаза; 5 – фаза отмирания); б – полунепрерывный; в – непрерывный; г – квазинепрерывный.
Методика культивирования коловраток. Массовое выращивание коловратки проводится под открытым небом в прудах, бассейнах или в бетонных танках. Технология их получения включает 3 этапа: выделение маточной культуры, подготовка емкостей для массового выращивания и собственно выращивание гидробионтов.
Выделенную из природных водоемов с помощью планктонной сетки культуру коловраток используют для предварительной разгонки в пластиковых ѐмкостях небольших объѐмов (1,5 – 2,0 м3). При небольшой плотности первоначального засева ( 0,5- 3,0 экз/мл) уже через неделю культура коловраток может выйти на так называемое «плато» [43] и использована для засева бетонных бассейнов.
Для быстрого разгона культуры коловраток на этом этапе рационально использовать смешанный корм (микроводоросли и сырые дрожжи). Суточная норма внесения их должна составлять не менее 5 -13 г/м3 сухого вещества. При этом популяция коловраток может достигать плотностей порядка 100-150 экз/мл, а ее продукция – 6,85 -15,42 млн.экз/м3 сут.
Одновременно с разгонкой маточной культуры коловраток готовят бетонную ѐмкость для массового выращивания. Ее наполняют морской водой, вносят минеральные удобрения и культуру микроводорослей. В качестве удобрения используют суперфосфат и аммиачную селитру, концентрации которых должны составлять 25-30 г/м3 . «Цветение» водорослей, как правило, начинается уже на 4-5 сутки после внесения удобрений. В этот момент вносят культуру коловраток из пластиковых бассейнов.
К сбору продукции коловраток приступают при достижении популяцией плотности порядка 30-40 экз/мл. После сбора урожая в бассейн добавляется свежая среда и корм. Соблюдение вышеперечисленных требований позволяет поддерживать культуру коловраток в стадии экспоненциального роста в течение 20-36 дней максимальная численность коловраток за это время может достигать 100-110 экз/мл, а их продукция 4.4-6,6 млн.экз/м3 сут. Сбор продукции осуществляется планктонными сетками с размером ячеи 76 единиц. Собранный урожай концентрируют в небольших объемах, подвергают обработке антибиотиками и используют на корм личинкам рыб.
