4.6. Процедуры пересева культур в стерильных условиях
4.6.1. Стерильные комнаты
Лучшим местом для манипуляций с культурами и стерильными материалами является ламинарный бокс с вытяжкой, размещенный в не- большой закрытой комнате. Если нет такого бокса, для пересевов можно использовать небольшое по размерам изолированное помещение. Эту ком- нату необходимо оборудовать ультрафиолетовой лампой и бунзеновской горелкой (или спиртовкой). Если нет возможности использовать комнату, то можно работать в обычной лаборатории, соблюдая меры стерильности. Независимо от оснащенности стерильного помещения, источником загряз нения может быть воздух, рабочая поверхность, внутренние поверхности сосудов, контейнеров и т.д. Поэтому все манипуляции следует проводить так, чтобы уменьшить риск загрязнения. В Соединенных Штатах перед на- чалом работы в воздухе распыляют лизол (Kawachi, Noel, 2005). Этот спрей нейтрализует коллоидные частицы в воздухе, такие как пыль и спо- ры, позволяя им осесть на поверхность стола или пола, после чего все по- верхности протирают 70% этанолом.
Рабочее место и материалы следует располагать таким образом, что- бы уменьшить циркуляцию воздуха (рис. 7). Исследователь должен совер- шать как можно меньше движений, все его движения должны быть мед- ленными. Следует избегать перекрещивания рук и хаотичных движений с пипетками в воздухе. Наличие ламинарного бокс с вытяжкой позволяет быть уверенным в том, что воздушная пыль не проникнет на рабочее ме- сто, однако следует постоянно проверять состояние фильтров бокса. Если фильтры загрязняются, то бокс становится потенциальным источником за- грязнения (Kawachi, Noel, 2005).
Рис. 7. Ламинарный бокс с горелкой Бунзена и лабораторными мате- риалами, организованный для работы праворукого человека (Kawachi, Noel, 2005). Порядок расположения материалов обозначен буквами от (a) до (f). Пробирки расположены в определенном порядке для облегчения ра- боты и избежания ошибок при пересеве
Перед работой необходимо проверить состояние стерильных мате- риалов, их не следует использовать, если нет уверенности в их чистоте. Обработать все рабочее место 70% этанолом. Перед работой следует на- деть латексные перчатки, которые нужно часто менять, или протирать ру- ки 70% этанолом. Рукава одежды являются основным источником загряз нения, поэтому рукава нужно закатать и обработать открытые участки ко- жи рук 70% этанолом. В качестве альтернативы можно использовать чис- тую одежду, обработанную УФ-лампой, которую не использовали за пре- делами комнаты для пересевов. Горелку Бунзена (или спиртовку) нужно поместить в центр ламинарного бокса, чтобы все операции проводились в пределах зоны с диаметром от пламени в 40см (рис. 7). Сосуд для исполь- зованных пипеток, одноразовых наконечников и других предметов нужно поместить справой стороны от человека (слева, если работает левша), что- бы уменьшить риск загрязнения. После организации рабочего места нужно зажечь горелку (спиртовку) и еще раз обработать руки 70% этанолом, из- бегая воспламенения спирта. Если стерильное оборудование (например, пипетка или одноразовый наконечник) случайно коснется внешних по- верхностей контейнера или другой склянки, его следует выбросить и заме- нить новым стерильным изделием. Содержимое стеклянных сосудов не следует наливать прямо в другой сосуд, если внешнюю поверхность около отверстия невозможно обработать пламенем. Ни при каких обстоятельст- вах нельзя повторно использовать одну и ту же пипетку! Таким же образом порцию стерильной среды, которая остается в пипетке после манипуляций, следует вылить в сосуд для утилизации, не допуская ее разбрызгивания и попадания микроскопических капель в стерильную среду (Kawachi, Noel, 2005).
4.6.2. Пересадка жидких культур водорослей
В настоящее время существует множество вариаций методики пере- сева культур в новую среду. Представленный в данном пособии метод прост и позволяет без особых усилий соблюдать необходимую стериль- ность при работе. Этот способ предполагает наличие ламинарного бокса с вытяжкой, в случае его отсутствия ряд этапов можно пропустить. Кроме того, описанный метод подразумевает использование многоразовых стек- лянных пипеток, при использовании одноразовых пипеток или наконечни- ков необходимы небольшие модификации этого метода. Наконец, реко- мендации разработаны для праворуких людей, леворукие люди должны внести небольшие коррекции (Kawachi, Noel, 2005).
Подготовительный этап. 1. Надеть защитную одежду, стерилизованную в УФ-лучах. Если эта одежда использовалась вне комнаты для пересевов, ее надо занести в ком- нату и включить УФ-лампу.
2. Выключить УФ-лампу, открыть дверь, стараясь широко не распа- хивать, медленно войти в комнату и осторожно закрыть дверь.
3. Включить вытяжку в ламинарном шкафу, если в боксе есть газо- вый кран, открыть его, однако кран горелки Бунзена должен быть закрыт.
4. Протереть рабочую поверхность 70% этанолом.
5. Поместить бунзеновскую горелку в центр. 6. Поставить коробку со стерильными одноразовыми или многоразо- выми пипетками слева как можно дальше (рис. 7).
7. Поставить склянки, колбы Эрленмейера, пробирки слева (на вто- рую позицию в хронологическом порядке использования в соответствии с рис. 7) на периферию в радиусе 40см от горелки Бунзена.
8. Положить грушу для пипеток справа от горелки Бунзена. Необхо- димо регулярно обрабатывать внутреннюю часть груши 70% этанолом и промывать внутреннюю часть отверстия. Никогда не следует использовать грушу, которую применяли для работы с химикатами (например, осмием, глутаральдегидом).
9. Поставить емкость для использованных пипеток на максимальное расстояние от себя справа (вне радиуса 40см от горелки).
10. Проверить наличие этикеток на всех емкостях для пересева. 11. После организации рабочего места необходимо открыть кран и зажечь горелку Бунзена. Обработать руки 70% этанолом или надеть сте- рильные перчатки. Манипуляции проводить внутри зоны на удалении 40см от горелки.
Процедура пересева.
12. Левой рукой нужно взять коробку с пипетками и поднести ее к горелке Бунзена на расстояние 20см. Открыть крышку правой рукой, дер- жа крышку между ладонью и безымянным и указательным пальцами (рис. 8a). Если крышка слишком велика для этих манипуляций, поднести крыш- ку к горелке и подержать в пламени.
13. Левой рукой слегка встряхнуть коробку таким образом, чтобы одна из пипеток вышла из коробки на несколько сантиметров (рис. 8b).
14. Правой рукой взять пипетку большим, указательным и средним пальцами, вытащить из коробки медленным движение (рис. 8с). Наконеч- ник пипетки не должен касаться никаких поверхностей.
15. Держать свои руки вблизи горелки Бунзена, работать с пипеткой и открывать сосуд лучше всего на расстоянии 20см от горелки.
16. Закрыть коробку крышкой, стараясь не допустить касания пипе- ток поверхностей (рис. 8d). Для предотвращения загрязнения во время по- вторных посевов культур, рекомендуется держать коробку с пипетками от- крытой на расстоянии 40см от горелки и доставать пипетки при помощи металлического пинцета, стерилизуемого в пламени перед каждой мани- пуляцией. В этом случае следует использовать все пипетки в коробке, или снова стерилизовать их перед следующим использованием.
17. Левой рукой переместить коробку с пипетками в ее обычное по- ложение.
18. Левой рукой достать пипетку большим и указательным пальцами за конец, закрытый ватной пробкой и поднести к пламени (рис. 9а).
19. Правой рукой взять грушу.
Рис. 8. Извлечение пипетки Пастера из емкости для хранения (Kawachi, Noel, 2005). Крышку емкости нужно держать в правой руке между ладо- нью и двумя другими пальцами. Все манипуляции нужно производить вблизи горелки Бунзена. a – открывание крышки емкости; b – «вытряхива- ние» пипетки из емкости; c – извлечение пипетки; d – закрывание емкости крышкой
21. Стерилизацию пипетки в пламене проводить не обязательно, од- нако, если это сделали, необходимо остудить пипетку в небольшом коли- честве стерильной среды.
22. Взять пипетку правой рукой возле груши (рис. 9с), а левой рукой – сосуд с культурой.
23. Переместить сосуд с культурой в правую руку, и с помощью ла- дони и мизинца правой руки открыть крышку сосуда, держа пипетку (рис. 10а). Пипетку надо держать вблизи горелки и не касаться никаких поверх- ностей.
24. Левой рукой осторожно поднести отверстие пробирки к пламени и медленно вращать пробирку под углом 45 ?, стараясь не дышать в сторо- ну сосуда с водорослями (рис. 10b). Не нагревать пластиковую посуду!
25. Левой рукой медленно переместить пробирку обратно от пламе- ни, держа под углом 45 ? для уменьшения загрязнения.
26. Медленно опустить наконечник пипетки в жидкость, стараясь не задевать стенок пробирки.
20. Надеть грушу на пипетку (рис. 9b).
27. Медленно набрать суспензию клеток в пипетку с помощью гру- ши, следя за тем, чтобы жидкость не доходила до ватной пробки, закры- вающей пипетку (рис. 10c). Набрать только необходимый объем суспензии водорослей, излишки необходимо вылить. Для уменьшения риска разлива- ния культуры после забора клеток груша должна принять первоначальное расширенное положение.
Рис. 9. Работа с пипеткой Пастера (Kawachi, Noel, 2005): a – перемещение пипетки из правой в левую руку; b – надевание груши на пипетку. Кончик пипетки должен находиться вблизи горелки Бунзена. Ватная пробка пре- дохраняет загрязнение пипетки со стороны груши; c – держа пипетку пра- вой рукой, медленно переместите в левую руку (ее не видно) для отбора культуры водорослей
28. После забора необходимого количества суспензии клеток пипет- ку следует медленно вынуть из пробирки, избегая контакта со стенками.
29. Повернуть пипетку горизонтально без надавливания на грушу и держать ее на расстоянии 20см от горелки Бунзена.
30. Снова поднести горлышко пробирки к пламени, повернуть (рис. 10d), не касаясь пипеткой никаких поверхностей.
31. Левой рукой медленно поднести пробирку к пробке, которую следует держать мизинцем и ладонью правой руки (рис. 10е). Более круп- ные крышки (например, пробки колб Эрленмейера), которые невозможно держать во время манипуляций, необходимо положить на рабочую по- верхность и подержать в пламени перед тем, как закрыть сосуд.
32. Закрыть пробирку крышкой, всегда помня о том, что пипетка не должна касаться никаких предметов и поверхностей. Не подносить пипет- ку близко к пламени, так как высокая температура может убить клетки.
33. Поставить закрытую пробирку на прежнее место. Лучше всего ставить пробирку с культурой на новое место, чтобы не поместить в нее культуру второй раз. Если пробирки находятся в штативе, необходимо разделять пробирки со средой и пробирки с инокулятом свободным рядом (рис. 7).
Рис. 10. Методика работы с пробиркой во время пересева (Kawachi, Noel, 2005). Пробку следует держать между ладонью и маленьким пальцем во время асептической работы: a – открывание пробки; b – обработка гор- лышка пробирки в пламени горелки; c – отбор суспензии клеток для пере- сева; d – повторная обработка горлышка пробирки в пламени; e – закрыва- ние пробирки пробкой
34. Медленно поднести левую руку к сосуду, в который будет вно- ситься суспензия водорослей.
35. Используя те же процедуры, которые были описаны выше, от- крыть новую пробирку, поднести горлышко к пламени и опустить пипетку в новую пробирку, не касаясь стенок.
36. Медленно вылить суспензию водорослей в пробирку и осторожно вытащить пипетку. Если кончик пипетки находится ниже уровня жидко- сти, следует избегать появления пузырьков.
37. Поднести горлышко сосуда к пламени и закрыть крышку так, как было описано выше, соблюдая меры стерильности.
38. Поместить пробирку с водорослями, закрытую крышкой, в штатив.
39. Выбросить использованную пипетку в специальный контейнер, соблюдая меры предосторожности для предотвращения разбрызгивания суспензии клеток на рабочую поверхность. Если разбрызгивание все-таки произошло, вытереть жидкость салфеткой, обработать 70% этанолом и снова протереть поверхность чистой салфеткой. Поменять перчатки или обработать руки 70% этанолом.
40. Поставить пипетку в контейнер для использованных пипеток. Ладонью и указательным пальцем свободной левой руки взять пипетку за конец с ватной пробкой, и осторожно удалить грушу с пипетки правой ру- кой (рис. 11а).
Рис. 11. Удаление остатков жидкости в стакан для утилизации (Kawachi, Noel, 2005): a - грушу следует удалять только тогда, когда пипетка нахо- дится над стаканом для предотвращения попадания жидкости на рабочую поверхность; b – стакан для утилизации должен быть устойчивым, чтобы при помещении в него большого количества пипеток он не опрокинулся; в стакане должно быть достаточное количество воды для его устойчивости и для того, чтобы кончики пипеток находились в жидкости.
41. Левой рукой поместить пипетку в контейнер, следя за тем, чтобы наконечник был полностью погружен в воду (рис. 11b). Вернуть грушу в нормальное положение. Рабочее место должно быть готово к следующему процессу инокуляции.
63
42. После окончания пересева выключить горелку Бунзена, уб- рать все материалы с рабочего места, и протереть все поверхности 70% этанолом.
43. Закрыть основной газовый кран, если он есть. Выключить систе- му вентиляции и включить УФ-лампу. Выйти из комнаты, осторожно от- крывая и закрывая дверь.
44. Снять защитную одежду и положить в специальный шкаф для стерилизации.
45. Лучше всего иметь специальную чистую обувь для пересевов. Перед входом в стерильную комнату для пересевов нужно положить ков- рик для протирания обуви. Грязь с обуви является одним из основных ис- точников загрязнения.
46. Перед допуском к работе необходимо проводить инструктаж и объяснять все правила соблюдения стерильности. Только после этого ис- следователя можно допускать к пересеву культур (Kawachi, Noel, 2005).
4.6.3. Пересадка агаровых культур
Процедура пересадки агаровых культур имеет ряд особенностей, но в це- лом характеризуется большим сходством с пересадкой жидких культур: 1-5. Эти пункты аналогичны методике пересадки жидких культур. 6. Положить микробиологическую петлю возле горелки Бунзена. Поставить пробирки или чашки Петри слева на периферию радиуса 40см от горелки.
7. После организации рабочего места повернуть газовый кран и за- жечь горелку Бунзена. Надеть стерильные перчатки или протереть руки 70% этанолом. С этого момента начинаются стерильные манипуляции, по- этому нужно работать внутри радиуса 40см вокруг горелки Бунзена.
8. Нагреть микробиологическую петлю в синей части пламени го- релки Бунзена до тех пор, пока металл не раскалится (рис. 12а).
9. Остудить петлю внутри зоны 20см от горелки Бунзена (рис. 12b). 10. Левой рукой переместить пробирку с культурой по направлению горелки внутрь зоны 2см от горелки.
11. При работе с пробиркой следуйте инструкции для пересадки жидких культур (см. п. 23-25). При работе с чашками Петри открыть крышку левой рукой под углом 45 ?, избегая касания внутренней части крышки (рис. 12с).
12. Медленно опустить петлю в пробирку и осуществить забор не- большого количества культуры, не царапая агар (рис. 12d).
13. Закройте крышку пробирки или чашки Петри крышкой (см. п. 30- 32 инструкции по пересеву жидких культур).
14. Медленно поднести свою левую руку к сосуду, в который будет пересаживаться культура.
15. Используя процедуру, описанную выше, открыть новый сосуд и аккуратно пересадить культуру на поверхность агара, не царапая ее. Ис- пользовать подходящую технику пересева (например, горизонтальные зиг- загообразные движения для пробирки или метод квадратов для чашки Петри). В любом случае, конец микробиологической петли не должен ка- саться стенок пробирки или чашки Петри.
Рис. 12. Пересев культур водорослей на агаризованные среды (Kawachi, Noel, 2005): a – нагревание платиновой петли в пламени горелки Бунзена; b – охлаждение микробиологической петли вблизи горелки Бунзена; c – от- крывание чашки Петри под углом 45 ?; d – посев культуры в пробирку, при этом следует избегать контакта петли со стенками пробирки, пробирку следует держать под углом 45 ? к поверхности
16. После пересева горлышко пробирки нагреть в пламени горелки и закрыть крышкой так, как описано выше, используя меры стерильности. При пересеве в чашки Петри закрыть крышку чашки Петри очень осто- рожно.
17. Нагреть конец микробиологической петли в синей части пла- мени до тех пор, пока металл не накалится. После остывания петли внутри зоны 20см от горелки петля готова к следующему пересеву.
18. Далее необходимо следовать инструкциям, приведенным в мето- дике пересева жидких культур (см. п. 42-46) (Kawachi, Noel, 2005).
