6.3. Методы и техники очистки

6.3.1. Очистка с использованием разницы в размере и фильтрация

Эти методы могут использоваться для очистки на нескольких уров- нях, но наиболее часто они применяются для очистки одновидовых куль- тур от нежелательных прокариот и дрожжей. Многократная очистка с ис- пользованием мембранных фильтров является одним из наиболее эффек- тивных методов в ходе очистки, так как большинство водорослей значи- тельно крупнее гетеротрофных бактерий. Когда нужный вид крупнее пор фильтра, на нем концентрируются клетки водоросли. После процедуры фильтрации фильтр необходимо промыть стерильной водой или средой. Для некоторых процессов необходимо только несколько клеток. Если тре- буется большее количество клеток водоросли, можно использовать фильтр с более крупными отверстиями или повторить процедуру фильтрации не- сколько раз.

Водоросли мелких или средних размеров могут быть очищены от дрожжей или других грибов путем многократной фильтрации. Гифы гри- бов могут быть отфильтрованы, однако их споры могут пройти через от- верстия фильтра вместе с водорослями. В этом случае можно добавить в фильтрат небольшое количество экстракта мальтозы или другой органиче- ской субстанции, к которой водоросли толерантны. Споры водорослей прорастают в течение 1 или 2 дней и образуют нити, которые могут быть удалены до образования новых спор. Для предотвращения прорастания преждевременно созревших спор процедуру необходимо повторить. Мно- гоступенчатая фильтрация может также использоваться для наименьших по размерам фотосинтезирующих видов. Так, например, Дж.Ватербери с коллегами (Waterbury et al., 1986) смогли получить штамм Synechococcus, свободный от других видов и гетеротрофных бактерий с использованием фильтра с порами размером 1 и 10?м и произвести окончательную очистку путем фильтрации.

Не доказано, что существует какое-либо простое определение взаи- мосвязи между номинальным размером пор фильтра и размером организ- мов при разделении. Этот вопрос исследовали в связи с оценкой продук- тивности пикопланктона с использованием фильтрации пресноводных и морских популяций. Образцы фильтровались последовательно через поры фильтра «Nucleopore» размером 3,0; 2,0; 1,0 и 0,2?м в диаметре. Эукарио- тические и прокаритотические пикопланктонные популяции были иссле- дованы с использованием флуоресцентной микроскопии на фильтрах (ге- теротрофные бактерии не исследовались). Основным выводом из этих исследований было то, что фильтр с порами 1,0?м не был универсальным для очистки (Guillard, 2005).

Хотя эти эксперименты не дали положительного результата для оценки продуктивности, они были очень полезны для выделения и очистки водорослей.

6.3.2. Дифференциальное центрифугирование

При очистке свободно живущих планктонных эукариот центрифуги- рование играет такую же роль, как и дифференциальная фильтрация. Цен- трифугирование продолжают до тех пор, пока более тяжелый организм не осядет на дно пробирки. После этого надосадочную жидкость удаляют. Эту процедуру можно повторять до тех пор, пока не получится нужный ре- зультат. В градиенте центрифугирования по плотности различные клетки уравновешиваются в градиенте в соответствии с их плотностью. Т.Зитц и Р.Шмидт (Sitz, Schmidt, 1973) отделили Synechococcus lividus Copeland от гетеротрофной бактерии в градиенте Фиколи, затем продолжили очистку на агаре. Центрифугирование особенно эффективно при сочетании ультра- звука с другими методами очистки клеток или колоний водорослей друг от друга, бактерий или детрита.

6.3.3. Использование ультразвука и перемешивание

Образцы из больших компактных колоний, водорослевых корок, влажных почв или грязи должны быть разделены вручную с помощью ножниц или пинцета. Следующие процедуры могут включать в себя из- мельчение водорослей между стерильными стеклами, очистки с помощью шприца или использование гомогенизирования (Rippka et al., 1981). Целью этих процедур является получение мелких и пригодных для манипуляций частиц. Эти же процедуры могут применяться к водорослям, соскоблен- ным с деревьев или других мягких субстратов, включая макрофиты. Одна- ко образцы со скал, раковин, кораллов или других пористых материалов требуют использования механической гомогенизации после просеивания или механического разделения. Иногда необходимо приготовить обога- щенные жидкие или агаровые культуры для получения разделяемых час- тиц водорослей.

Два вида аэрофильной водоросли Trentopohlia были очищены до ак- сеничной культуры путем перемещения коротких нитей через агар при по- мощи микроманипулятора Шермана (Lim et al., 1992). Водоросли соскаб- ливали с поверхности скал (T.aurea (L.) Martius) и деревянных стен (T.odorata (Wiggers) Wittrock), встряхивали в дистиллированной воде для разделения нитей на короткие фрагменты, которые помещали на поверх- ность агара в чашках Петри. Отдельные нити по 3-5 клеток поднимали специальным крючком и протаскивали через агар для удаления загрязни- телей. В случае с T.aurea, которая имела более длинные клетки и более же- сткие нити, не все загрязнители были удалены при протаскивании через агар. Для дальнейшей очистки применяли промывание 5% молочной ки- слотой в течение 30 минут и дальнейшее ополаскивание. Примерно поло- вина нитей выжила, из некоторых были получены аксеничные культуры. Микроманипулятор, описанный Д. Трондсеном (Throndsen, 1973), исполь- зовался в качестве микропипетки, микрокрючок – для захватывания от- дельных водорослевых частиц. Эти приспособления позволили изолиро- вать культуру из отдельной капли.

Для материала с разделяемыми частицами водорослей лучшим способом очистки является обработка ультразвуком с последующим центрифугированием. Эта методика использовалась для очистки бакте- рий (Solp, Starr, 1981), микроводорослей, цианобактерий, включая Mi- crosystis (Watanable et al, 1985). М.Ватанабе с коллегами (Watanable et al, 1985) разделяли загрязненную культуру Microsystis в течении 30с при частоте 20кГц, в результате чего большинство колоний разделялось на отдельные клетки. Культуральный материал центрифугировали и рас- творяли в дистиллированной воде 4 раза, после чего отдельные клетки изолировали с помощью микропипеток. М.Ширай с соавторами (Shirai, 1989) помещали материал на агаризованную среду с использованием та- ких же методов разделения и центрифугирования. Для очистки эукарио- тических водорослей также использовали ультразвук более низкой час- тоты (90кГц) в течение 5-20мин после повторного центрифугирования (Brown, Bischoff, 1962).

Ультразвук использовался для получения чистых культур миксо- бактерий (Sutherland,1976). Для этого вегетативные клетки миксобакте- рий и других загрязнителей уничтожали соответствующей обработкой ультразвуком. Микроцисты миксобактерий были более устойчивы к ультразвуку и давали впоследствии чистые культуры. Эта методика мо- жет применяться для эукариотических водорослей и цианобактерий, ко- торые имеют споры или другие устойчивые стадии развития. Данные об эффекте времени обработки ультразвуком представляют особый инте- рес.

Как ультразвук, так и центрифугирование уменьшает активную защиту поверхности клеток, что способствует росту прикрепляющихся к клетке организмов. При использовании ультразвука может происходить разрушение клеточных структур, центрифугирование также может вы- зывать разрушение клеток (Nelson, Brand, 1979).

6.3.4. Очистка путем разведения

Очистка путем многократного разведения культуры – один из наи- менее трудоемких методов очистки. Он наиболее эффективен, когда соче- тается с повторной асептической фильтрацией или центрифугированием. Перед серией разведений в культуру необходимо добавить антибиотики или другие химикаты. По нашим сведениям, никому не удавалось полу- чить чистую культуру путем последовательного разведения культуры по- сле использования антибиотиков. В результате этой процедуры были бы удалены фотосинтезирующие прокариоты, так как они рассматривались бы как загрязнители.

В природных образцах нефотосинтезирующие бактерии по числен- ности превосходят все другие организмы. Таким образом, многократное разведение не пригодно для очистки полевых образцов. Однако некоторые исследователи (Waterbury et al., 1986) добились успеха в очистке культуры Synechococcus из образца морской воды (с концентрацией клеток 105/мл). Они концентрировали раствор и очищали его от гетеротрофов путем диф- ференциальной фильтрации (фильтры 1 и 10?м «Nucleopore»). Во всех пробирках с разведением 1:104 водорослей наблюдался их рост (в некото- рых пробирках - вместе с другими водорослями). В большинстве пробирок с разведением 105 была культура Synechococcus (Waterbury et al., 1986). Для значительного разведения иногда требуется до 120 пробирок. Таким обра- зом, непосредственная очистка без обогащенных культур возможна, если концентрация загрязнителей уменьшается в том же порядке, что и значе- ние концентрации культуры, и используется большое количество разведе- ний (Guillard, 2005).

6.3.5. Агаровые чашки

Очистка с помощью чашек с агаром – один из первых и часто ис- пользуемых методов, однако он эффективен только для водорослей, кото- рые могут расти как на поверхности агара, так и внутри. Для таких водо- рослей это еще и метод выбора для изоляции одновидовых культур. Наи- более подробно метод агаровых пластинок рассмотрен в справочнике «Во- доросли» (1989). В агар часто добавляют антибиотики или другие селек- тивные агенты. Некоторые нитчатые водоросли могут расти или скользить далеко от загрязнителей по поверхности агара, как это могут делать неко- торые диатомовые или споры цианобактерий. Некоторые виды обладают фототактическим движением, которое можно обнаружить при помещении чашки с культурой непосредственно под источник света.

Приготовление питательных сред иногда является критическим мо- ментом. Со времен Е.Прингшейма известно, что лучше всего автоклавиро- вать агар отдельно, однако эта процедура легче выполнима для пресновод- ных видов (Allen, 1973). Низкотемпературная и ультранизкотемпературная агароза (застывающая при t=17 ?C) может использоваться для чувствитель- ных к температуре видов и предотвращения снижения активности анти- биотиков, которые не переносят высокотемпературного шока. Агароза, за- стывающая при низкой температуре, важна для очистки пресноводной цианобактерии Microcystis. Этот процесс может сочетаться с воздействием ультразвука и центрифугированием (Watanable et al., 1985). Данный способ также важен для очистки пресноводной водоросли Synechococcus с ис- пользованием техники «бедной» культуры (Watanable et al., 1998).

Агароза также используется для более высокой степени чистоты культуры по сравнению с агаром, который загрязнен многими контами- нантами (Guillard, 2005).

6.3.6. Очистка с помощью микропипеток

Этот способ в основном схож с теми процедурами, которые ис- пользуются для получения одновидовых культур с более высокими требованиями к стерильности. Организмы должны изолироваться непо- средственно в чистую культуру с помощью микропипетки. Однако бо- лее распространенным способом является получение чистой культуры из обогащенной, одновидовой или аксеничной, а не очистка загрязнен- ной культуры. Техники и оборудование, применяемые для этого про- цесса, были детально описаны для каждого исследуемого объекта (Во- доросли, 1989; Guillard, Morton, 2003). М. Друп (Droop,1969) отмечал, что манипуляции по очистке требуют терпения и навыка, но, как и езда на велосипеде, после приобретения опыта не представляют особой трудности, так и этот способ можно легко освоить.

Процедура использования микропипетки заключается в следую- щем. Если жизнеспособная культура растет быстро, то плотность этой культуры может быть уменьшена наполовину (она сможет хорошо рас- ти после пересева). В связи с этим, обогащенные культуры должны сортироваться по размерам с использованием фильтра «Nucleopore» и других фильтров для достижения высокой концентрации. Потом очи- щенную культуру необходимо промыть над фильтром стерильной сре- дой (не содержащей загрязнителей размером с бактерии). На фильтре должны задерживаться клетки водорослей, но бактерии должны прохо- дить через отверстия фильтра. Клетки водорослей не должны высыхать на поверхности фильтра. Необходимо дважды промыть клетки водо- рослей, переместив их с помощью пипетки на поверхность нового стерильного фильтра. После окончания промывки следует перенести клет- ки водорослей в стерильную пробирку или колбу. Эти процессы не займут много времени, если все оборудование подготовлено заранее. Для многих видов водорослей, особенно флагеллят, рекомендуется по- местить промытую культуру обратно в привычные условия культиви- рования на короткое время – примерно на 1 час. Если необходимо ис- пользовать антибиотики, то в колбу с антибиотиком или другим хими- катом вносят промытую культуру в качестве инокулята. В тех случаях, когда антибиотик не используется, изоляция с помощью микропипетки может начинаться немедленно. Выбранная клетка обычно помещается в ванночку для промывания, по крайней мере, один раз перед помещени- ем ее в пробирку для культивирования (даже если она была взята из раствора с антибиотиком). При каждом промывании во время пересева необходимо использовать новую пробирку, чтобы бактерии не попали вместе с клетками водорослей. Лучше поместить клетки водорослей в среду (воду) стерильной микропипеткой. Рекомендуется использовать бинокулярный микроскоп, так как размеры капли намного больше кле- ток водорослей. В случае очень мелких клеток нужно работать при большем увеличении микроскопа (Guillard, 2005).

6.3.7. Использование антибиотиков

Хотя с помощью антибиотиков теоретически можно уничтожить все бактерии в смешанных культурах с сохранением водорослей, на практике это практически невозможно. Эти методики уменьшают количество бакте- рий до ничтожно малых количеств. Однако даже при пересеве одной клет- ки водорослей бактерии могут попасть в свежую среду. В основном выбор антибиотика определяется видом антибиотика, его концентрацией и вре- менем использования. Если при использовании одного антибиотика не удалось уничтожить все бактерии, то желаемого результата можно достичь при использовании другого антибиотика.

Не существует однозначных рекомендаций по использованию анти- биотиков, однако можно выделит несколько важных моментов:

- при применении антибиотиков, замедляющих синтез клеточных стенок, для стимуляции деления клеток необходимо добавлять некоторое количество органических веществ, так как эти антибиотики убивают бак- терии только во время активного роста клеток;

- не рекомендуется одновременное использование ингибиторов де- ления клеточной стенки (например, пенициллина) и ингибиторов клеточ- ного роста (Guillard, 2005).

6.3.8. Очистка с помощью ультрафиолетового облучения

Успешность использования этой процедуры определяется различия- ми между водорослями, гетеротрофными бактериями и вирусами в реак- ции на ультрафиолетовое облучение (УФО) и фотосинтетическую солнеч- ную радиацию (ФСР). Восприимчивость к УФО является основным разли- чием между этими организмами, хотя некоторые бактерии чрезвычайно устойчивы к облучению.

В основном действие УФО является результатом непосредственной абсорбции отдельных протонов специфическими молекулами. В случае повреждения или гибели происходит разрушение нуклеотидных последо- вательностей или нуклеиновых кислот.

Воздействие УФО может применяться в случаях, когда бактерии прикрепляются к более крупным клетками водорослей. Нуклеиновые ки- слоты вирусов и бактерий менее защищены, поэтому они легче поврежда- ются и вызывают гибель этих организмов (Guillard, 2005).

6.3.9. Проверка загрязненности

Эти методики включают микроскопические исследования с исполь- зованием многочисленных приемов: светлого и темного поля, фазового контраста, эпииллюминантной флуоресценции. При соблюдении стериль- ности во время манипуляций, с помощью электронной микроскопии мож- но также обнаружить внутри- и внеклеточное загрязнение. «Плавающая» цитометрия является обычной процедурой для определения бактерий (Guillard, 2005).

Контрольные вопросы 1. Дайте определение понятия «аксеничная культура». 2. Перечислите основные методы очистки водорослей. 3. Опишите последовательность очистки и изоляции одноклеточных водорослей. 4. В чем заключается особенность дифференциального центрифугирования как способа очистки водорослей? 5. Приведите примеры, когда исследователи смогли получить чистые культуры водорослей при помощи того или иного метода. 6. Опишите метод очистки водорослей путем многократного разведения. 7. Какие проблемы связаны с использованием антибиотиков для очист-

ки культур водорослей? 8. Укажите границы применения ультафиолетового облучения при культивировании водорослей.