7.2. Организация функционирования коллекций культур

7.2.1. Методики пересева

Перед началом пересева необходимо тщательно проверить этикетки во избежание ошибок. Лучше всего снабдить этикетками посуду и сте- рильные среды перед пересевом. После этикетирования пробирки с пере- сеянными культурами должны быть организованы в том же порядке, что и культуры перед пересевом.

Во время пересева необходимо соблюдать условия стерильности. Пересев необходимо проводить в стерильном боксе или специальной ком- нате для пересева, если это возможно. Все оборудование должно быть предварительно стерилизовано. Контейнеры должны легко открываться для уменьшения риска загрязнения. Оборудование для пересева должно иметь горелку, микробиологическую петлю, специальный крючок или пинцет для пересева нитчатых водорослей, а также одноразовые петли и пипетки. Пересев жидкой культуры может проводиться путем разливания среды или с использованием пипеток. Пипетки должны иметь ватную пробку на конце и быть стерильными. Не рекомендуется использовать ре- зиновые наконечники для пипеток, так как они могут быть загрязненными. Ватная пробка препятствует попаданию загрязнителей в культуру (Lorenz et al., 2005).

7.2.2. Пересев агаризованной среды

При пересеве колоний водорослей на агар микробиологическую пет- лю стерилизуют в пламени горелки до накаливания, затем, остудив, пере- мещают колонии водорослей. При посеве на чашки Петри крышку чашки только слегка приподнимают для предотвращения загрязнения. При посеве в пробирки или колбы посуду открывают вблизи пламени горелки. Если происходит пересев в несколько пробирок, крышки пробирок нужно слег- ка ослабить перед пересевом. Концентрация водорослей во вновь пересе- янной культуре обычно составляет 1-10% в объемном отношении. При пе- ресеве на косяки с агаром посевной материал нужно перемещать от осно- вания косяка к вершине. Это важно для того, чтобы вновь посеянные клет- ки хорошо освещались. Необходимо помнить, что при многократном ис- пользовании микробиологическая петля должна стерилизоваться перед каждым применением. На агаровых чашках большинство водорослей мо- гут жить на поверхности или внутри агара (некоторые цианобактерии). Эти водоросли не могут пересеиваться без частичек агара. Для очистки во- дорослей от старого агара может использоваться маленький скальпель. Можно также поместить кусочек водорослей вместе с твердой средой в жидкую на несколько часов, затем промыть водоросли и пересадить на но- вую среду с помощью пипетки.

При пересеве с агара на жидкую среду лучше всего отрезать малень- кий кусочек агара вместе с водорослями и поместить в жидкую среду. При пересеве с жидкой среды на твердую 2-3 капли среды вместе с водоросля- ми помещаются на поверхность агара и распределяются стеклянной палоч- кой (Lorenz et al., 2005).

7.2.3. Пересев жидкой культуры

Осторожно поместить несколько капель или миллилитров среды в новую посуду, содержащую свежую среду. Горлышки колб и пробирок не- обходимо держать над пламенем. Необходимо иметь запас стерильной по- суды на случай, если пробирка или колба разобьется. Для многих водорос- лей (зеленых коккоидных форм, цианобактерий), культуру необходимо пе- ремешать, а затем пересадить. Однако энергичное перемешивание может разрушить некоторые водоросли (Lorenz et al., 2005).

7.2.4. Пересев нитчатых водорослей

Некоторые нитчатые водоросли могут быть пересажены с помощью пипетки или разливанием на агаре, в то время как другие требуют приме- нения специальных методов. Иногда необходимо налить небольшое коли- чество культуры в чашку с агаром, отрезать кусочек нити скальпелем и

109

только после этого поместить материал в жидкую среду (Lorenz et al., 2005).

7.2.5. Условия культивирования

Поддержание метаболически активных культур водорослей основано на решении трех основных задач: сохранении запасных культур, достиже- нии специального морфологического и физиологического статуса и массо- вое культивирование (> 200мл жидкости). Достижение указанных целей возможно при создании необходимых условий для оптимального роста, которые различаются в зависимости от вида. Однако для хранения культур необходимы субоптимальные температура и интенсивность света, эти фак- торы сходны для разных водорослей. В этом случае основной целью явля- ется сокращение числа пересевов путем удлинения интервалов между ни- ми. Достижению этой цели способствует также применение специальных сред, способствующих удлинению интервала между пересевами. Вновь пересеянная культура часто инкубируется в оптимальных условиях в тече- ние короткого времени до достижения необходимой биомассы и восста- новления штамма, после чего она помещается в субоптимальные условия (Lorenz et al., 2005).

7.2.6. Выбор среды культивирования

Некоторые водоросли плохо адаптируются к специфическим пита- тельным средам в условиях стресса и в конечном итоге могут изменить свою морфологию. В качестве примеров можно привести потерю колони- ального статуса вольвоксовых водорослей и водорослей рода Pediastrum, потерю жгутиков хламидомонадами, а также утрату специфических черт оболочки некоторыми цианобактериями. В течение долговременного куль- тивирования, в условиях, очень резко отличающихся от естественных, мо- жет происходить отбор генетических форм, приспособленных к искусст- венным условиям. Например, при культивировании в среде с высоким со- держанием азота у цианобактерий может уменьшиться количество или да- же наблюдается отсутствие гетероцист.

Культуры водорослей могут очень сильно измениться со временем даже при сохранении условий культивирования и достатке всех необходи- мых элементов. Например, рН культуры очень часто изменяется без необ- ходимого буфера, и некоторые микроэлементы окисляются или изменяют- ся, особенно при искусственном освещении.

При использовании различных агаризованных сред, качество и чис- тота компонентов для среды играет важную роль для роста водорослей. В случае применения некачественных компонентов для среды жизнеспособ- ная культура может внезапно погибнуть.

Одним из важных моментов при культивировании водорослей явля- ется следующий: какая среда (жидкая или агаризованная) лучше подходит для долгосрочного культивирования водорослей? Выбор среды определя- ется многими факторами. Твердая среда предпочтительнее, так как она легче в обращении и менее подвержена загрязнению. Однако многие фла- гелляты и другие планктонные организмы плохо растут на агаре, в то вре- мя как многие почвенные и бентосные водоросли хуже культивируются на жидкой среде. Эти факты демонстрируют важность понимания специфики естественных условий обитания для организмов.

Другим важным моментом, на который необходимо обратить вни- мание, является выбор: какая среда (минеральная или с добавлением орга- нических веществ) лучше подходит для долговременного культивирова- ния? Неаксеничные фотоавтотрофы желательно культивировать на мине- ральной среде для предотвращения загрязнения гетеротрофными контами- нантами. С другой стороны, штаммы, которые должны культивироваться строго аксенично, иногда лучше выращивать в присутствии органических добавок для того, чтобы нефотосинтезирующие контаминанты могли быть выявлены сразу после загрязнения культуры. Добавление органических веществ или витаминов (B

1

– тиамина или B

12

– цианокобаламина) часто помогает вернуть жизнеспособность культуре. Хорошему росту в течение длительного времени также способствует двухфазная среда, содержащая воду и почву (особенно для нитчатых зеленых и Euglenophyta). Добавление почвенного экстракта также помогает вернуть измененный морфологиче- ский статус.

Крупные коллекции водорослей имеют многочисленные культуры водорослей, поэтому необходимо использовать разнообразные питатель- ные среды. Для облегчения работы, при длительном культивировании за- частую используются стандартные среды (Lorenz et al., 2005).

Разнообразные прописи питательных сред, рекомендуемых для тех или иных групп водорослей, можно встретить в многочисленных статьях и обзорах (Почвенные водоросли, 1969; Масюк, 1973; Сиренко и др., 1975; Культивирование..., 1983; и др.). Прописи сред, наиболее широко исполь- зуемых в практике культивирования водорослей, указаны в Приложении 1 данного пособия.

7.2.7. Свет и температура

Установлено, что стандартная интенсивность света 10-30 ?моль фотонов?м-2?s-1 в комбинации с соответствующей температурой под- ходят для большинства таксонов водорослей. Использование избыточ- ного освещения является наиболее распространенной ошибкой при долговременном культивировании. Другой проблемой может быть чрезмерно высокая температура. Чередование света и темноты необ- ходимо для поддержания многих культур. Многие водоросли могут погибнуть в условиях постоянного освещения. В большинстве коллек- ций чередование света и темноты осуществляется в режиме 12:12ч или 16:8ч. Неподходящие режимы чередования света и темноты могут привести к нежелательным фотопериодическим эффектам (например, формированию цист).

Водоросли с фикобилисомами предпочитают низкий уровень осве- щенности (меньше 10 ?моль фотонов?м-2?s-1). Другие водоросли (напри- мер, большинство динофлагеллят) нуждаются в свете более высокой ин- тенсивности (более 60-10 ?моль фотонов?м-2?s-1). Бесцветные водоросли (Astasia, Polytomella, Prototheca) лучше хранить в закрытой посуде.

Температура является очень важным фактором и должна строго контролироваться. Условия культивирования могут различаться в пре- делах одного департамента или лаборатории, но они должны периоди- чески проверяться. В основном, температура должна поддерживаться на уровне ±2 ?С. Пресноводные водоросли более толерантны к измене- нию температуры, чем морские виды. Многие пресноводные виды мо- гут успешно культивироваться при t=15-20 ?С. Однако некоторые крупные коллекции культур (например, Culture Collection of Algae at the University of Texas – UTEX) культивирует все штаммы при t=20 ?С. Инкубирование при температуре свыше 20 ?С должно сопровождаться увеличением интенсивности света для предотвращения фотоингиби- рования и повреждения. Поэтому температура выше 20 ?С не подходит для культивирования большинства водорослей. Кроме того, при по- вышении температуры увеличивается и интенсивность испарения (Lo- renz et al., 2005).

7.2.8. Частота пересевов

При постоянном культивировании основной целью является сохра- нение организма в конце экспоненциальной фазы роста. В большинстве крупных коллекций культур наименее коротким интервалом между пере- севами является интервал в 1-2 недели, и этот режим пересевов поддержи- вается для очень незначительного числа чувствительных штаммов. Неко- торые штаммы зеленых водорослей и цианобактерий, культивируемые на косяках при низкой освещенности и при t=10 ?С, пересаживаются один раз в 6 месяцев. Оптимальным интервалом для пересаживания является одна четверть времени, в течение которого водоросль может жить на среде без пересаживания (Lorenz et al., 2005).

7.2.9. Определение оптимальных условий культивирования для новых изолятов

Вновь изолированные штаммы вызывают определенные сложности при культивировании, так как неизвестны оптимальные условия для их поддержания. Для определения оптимальных условий культивирования необходимо провести тест, выращивая культуру при различной освещен- ности и температуре (начиная с самых низких уровней). Необходимо по- стоянно записывать данные об условиях выращивания, это важно для дальнейшего культивирования. Иногда случается, что культура хорошо растет при разных условиях, а затем внезапно погибает. Это зачастую про- исходит тогда, когда водоросль растет на искусственной среде или при не- достатке некоторых факторов роста (микроэлементы, витамины). Поэтому можно рекомендовать выращивать новую культуру на различных средах: если водоросль погибнет в одной среде, она может выжить на других (Lo- renz et al., 2005).

7.2.10. Установки для культивирования

Культуры водорослей должны равномерно освещаться. Водоросли лучше растут в колбах, однако они занимают больше места. Пробирки для культивирования должны быть достаточно широкими, что более удобно при пересеве культуры. Многоразовые крышки более удобны, но их нужно стерилизовать перед применением. Некоторые представители Conjugato- phyceae и большинство планктонных пресноводных диатомей лучше куль- тивируются в колбах Эрленмейера, некоторые динофлагелляты лучше рас- тут в пластиковых колбах.

Крышки должны плотно закрываться для предотвращения загрязне- ния. Могут использоваться стеклянные, металлические, пластиковые крышки или ватные пробки. Ватные пробки нужно заворачивать в метал- лическую фольгу или водонепроницаемую бумагу для предотвращения испарения. При использовании парафильма может наблюдаться развитие грибов. Лучше всего использовать силиконовые крышки, так как они очень плотно закрываются и предотвращают испарение без затруднения газооб- мена (Lorenz et al., 2005).

7.2.11. Оборудование и условия, необходимые для постоянного культивирования

Специальное оборудование для культивирования варьирует от про- стых полок для северного окна и освещенных инкубаторов, до специаль- ных комнат для культивирования (рис. 21,22). Обычно комната с регули-

 

руемыми условиями хорошо подходит для небольшого числа культур. Для больших коллекций хорошо подходят специальные инкубаторы, но они очень дороги в эксплуатации. Холодильники с прозрачными дверцами, ко- торые используются в продовольственных магазинах, могут быть более дешевой альтернативой таких инкубаторов.

Рис. 21. Комната для культивирования водорослей в Университете Джона Кэрролла (США)

Стойки и полки должны обеспечивать равномерное освещение и температурный контроль и быть легкодоступными. Различное число куль- тур должно храниться вместе на специальных тестовых стойках. Полки должны быть изготовлены из стекла или металла, так как их легко обраба- тывать для стерилизации. Наиболее оптимальны полки из металлической сетки, так как они обеспечивают хорошую циркуляцию воздуха. Источни- ки света должны располагаться над или в стороне от полок для предотвра- щения перегревания.

 

Для культивирования водорослей нужно поддерживать определен- ную температуру. Лучше всего расположить компрессоры вне здания. В целях индикации изменения температуры более чем на 2-4 ?С можно ис- пользовать специальные звуковые системы.

Рис. 22. Изоляты водорослей в комнате для культивирования в Уни- верситете Джона Кэрролла (США)

Для освещения культур лучше всего использовать рассеянный свет. Попадание прямого солнечного света может привести к чрезмерному на- греванию и гибели культуры.

При культивировании водорослей также необходимо поддерживать определенную влажность. Это необходимо не только для предотвращения чрезмерного испарения, но и для предотвращения загрязнения водорослей. Например, споры грибов хорошо развиваются при влажности воздуха 60% и выше.

Поддержание чистоты в культуральных помещениях является важ- ным условием культивирования. Все поверхности должны обрабатываться 70% раствором этанола. Полевые образцы, почва и другие биологические материалы должны храниться отдельно от культур водорослей (Lorenz et al., 2005).

 

7.2.12. Поддержание порядка в хранении культур

Для долговременного хранения культур водорослей должна сущест- вовать специальная система этикетирования. Нумерация штаммов является наиболее простым и эффективным средством поддержания порядка. На- звания видов и родов могут изменяться (при применении более точной идентификации), но номер штамма должен быть постоянным. Можно ре- комендовать следующую информацию для этикетки: научное название ви- да, номер штамма, среда культивирования. Одновременное использование названия вида и номера штамма снижает риск ошибки. Для небольших коллекций можно рекомендовать также дату пересева. Дополнительную информацию о каждом штамме можно указать в базах данных и картотеке.

Этикетки должны быть легко читаемыми, водостойкими и легкими для замены.

Для снижения риска потери штамма культуру следует хранить как минимум в двух повторностях. Можно рекомендовать следующий порядок хранения культуры: 2 пробирки после последнего пересева, 2 пробирки из предпоследнего пересева и 1 пробирку из более ранних пересевов для мед- ленного роста хранить отдельно (Lorenz et al., 2005).

Контрольные вопросы 1. Какова роль коллекций культур водорослей в современной биоло-

гии? 2. Перечислите условия, необходимые для функционирования кол-

лекций культур водорослей. 3. Чем обусловлен выбор среды для культивирования? 4. Какие уровни освещенности и температуры являются оптимальны-

ми для сохранения жизнеспособности водорослей? 5. С какой частотой необходимо пересаживать водоросли? 6. Какое оборудование используется для культивирования водорос-

лей? 7. Как поддерживается порядок в хранении культур?