ГЛАВА 3. МИКРОСКОП И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
3.1. Устройство микроскопа
Изучение не видимых невооруженным глазом клеток микроорга- низмов, размеры которых не превышают десятков или сотен микрометров (1 мкм = 0,001 мм), возможно только при помощи микроскопов (от греч. «micros» – малый, «scopeo» – смотрю). Эти приборы позволяют получать в сотни раз (световые микроскопы) и десятки-сотни тысяч раз (электронные микроскопы) увеличенное изображение исследуемых объектов.
При помощи микроскопа изучают морфологию клеток микроорга- низмов, их рост и развитие, проводят первичную идентификацию (от лат. «identificare» – отождествление) исследуемых организмов, ведут наблю- дения за характером развития микробных ценозов (сообществ) в почве и других субстратах.
Микроскоп состоит из двух частей: механической (подсобной) и оп- тической (главной) (Теппер и др., 1993).
3.1.1. Механическая часть микроскопа
К ней относят штатив, предметный столик и тубус (труба). Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме ду- ги. К нему примыкает коробка механизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением винтов грубой и тонкой настройки (рис.1).
Винт грубой настройки (макровинт) служит для предварительной, ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта на фокус.
Винт тонкой настройки (микровинт) используют для последую- щей, более четкой установки на фокус. При полном повороте микро- винта тубус передвигается на 0,1 мм (100 мкм). При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается по направлению к препарату, при вращении против нее идет от препарата.
На предметный столик помещают препарат с объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается во взаимно пер- пендикулярных плоскостях при помощи винтов. В центре столика нахо- дится отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляе- мыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) – пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепле- ния препарата.
Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская пропусков (это важно при подсчете), или если во время работы требуется повторное наблюдение какого-либо определенного участка препарата, на предметный столик помещают препаратоводитель. На этом приспособле нии имеется система линеек – нониусов, при помощи которых можно за- координировать любую точку исследуемого объекта. Для этого при уста- новке препаратоводителя совмещают центр вращения столика и оптиче- скую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратово- дителя по кресту (отсюда предметный столик с препаратоводителем назы- вают иногда крестообразным).
Рис. 1. Устройство светового микроскопа (Грин и др., 1996)
Тубус – это оправа, в которую заключены элементы оптической сис- темы микроскопа. К нижней его части прикрепляют револьвер (объективо- держатель) с гнездами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечи- вает горизонтальное положение предметного столика (Теппер и др., 1993).
3.1.2. Оптическая часть микроскопа
Она состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) (рис.1) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Все части оптической и осветительной систем строго центрированы в отношении друг друга. Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света.
Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала пло- ская, другая – вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользо- ваться только плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений.
Конденсор (от лат. «condense» – уплотняю, сгущаю) состоит из двух- трех короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и на- правляет их на объект. Конденсор необходим, прежде всего, при работе с иммерсионной системой (см. 3.3.4). Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяю- щим перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом.
Для регулирования интенсивности освещения в конденсоре есть ири- совая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пла- стинок. Чтобы получить более четкое изображение исследуемого объекта, регулируют степень раскрытия диафрагмы. Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные – при уменьшенном отверстии диафрагмы.
Под конденсором располагается кольцевидный держатель для свето- фильтров (обычно к микроскопу прилагаются синее и белое матовые стек- ла). При работе с искусственным источником света светофильтры создают впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз (Теппер и др., 1993).
Объектив (от греч. «objectum» – предмет исследования) – наиболее важная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта.
Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называ- ется фронтальной, она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в сис- теме объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптиче- ских недостатков, возникающих при исследовании объектов. Один из та- ких недостатков – следствие явления сферической аберрации. Это явление связано со свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В ре- зультате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.
Хроматическая аберрация возникает при прохождении через линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломляясь по-разному, лучи пе- ресекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.
К объективам, устраняющим сферическую аберрацию и частично хроматическую, относятся ахроматы. Они содержат до шести линз, кор- ректируют первичный спектр (желто-зеленую часть спектра), но не устра- няют вторичного спектра. Объективы, устраняющие хроматическую абер- рацию и для вторичного спектра, называются апохроматами. В их составе может быть до 12 линз. В объективах-планахроматах и планапохроматах скорректированы и сферическая, и хроматическая аберрации. Их исполь- зуют при микрофотографировании.
Апохроматы дают возможность устранить окрашивание объекта и по- лучить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета. Максимального эффекта при работе с апохроматами можно достичь, одновре- менно используя компенсационные окуляры, возмещающие оптические недостатки объективов. Хроматическая ошибка таких окуляров обратна хроматической ошибке объектива. В результате хроматическая аберрация микроскопа оказывается почти полностью компенсированной.
Объективы бывают сухие и погружные, или иммерсионные. При ра- боте с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объек- том исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает работу с ними при по- гружении фронтальной линзы объектива в однород- ную жидкую среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1) часть световых лучей отклоняет- ся и не попадает в глаза наблюдателя (рис. 2).
Рис. 2. Ход лучей в сухой и иммерсионной сис- темах: I - V – лучи света (Теппер и др., 1993).
При работе с иммерсионным объективом между покровным стеклом и линзами объектива помещают кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. Кедровое масло полу- чают из семян виргинского можжевельника Juniperus virginiana L. или зе- равшанской арчи Juniperus seravschana Kom. Последнее время иммерси- онной жидкостью чаще служат синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу. Лучи в оптически однородной гомогенной среде не меняют направления (Теппер и др., 1993).
На оправе иммерсионных объективов есть черная круговая нарезка и обозначения: I – immersion (иммерсия), HI – homogen immersion (однород- ная иммерсия), OI (oil immersion), МИ – масляная иммерсия.
Объективы различают по увеличению. Собственное увеличение объ- ективов определяют по формуле:
V = l / f, где l – оптическая длина тубуса, или расстояние между фокальной плоскостью объектива и плоскостью изображения; для разных объективов оно колеблется в диапазоне 128... 180 мм;
f – фокусное расстояние объектива. Чем больше фокусное расстояние, тем меньше увеличение объектива. Обозначения увеличений объективов отмечают на их оправе. Каждый объ- ектив характеризуется, кроме того, определенной величиной рабочего рас- стояния в миллиметрах.
У объективов с малым увеличением расстояние от фронтальной линзы объектива до препарата (объекта) больше, чем у объективов с большим увеличением. В связи с этим необходимо строго следить, каким винтом – макрометренным или микрометренным – пользоваться при фокусировке объектива. Так, у объективов с увеличением 8?, 40? и 90? рабочие рас- стояния соответственно 13,8; 0,6 и 0,12мм. Для иммерсионного объектива рабочее расстояние составляет 0,12мм, поэтому его нередко называют "близоруким". У объективов малых увеличений не только большие рабочие расстояния, но и большие поля зрения. В связи с этим рекомендуется начинать исследование препарата с небольшого увеличения.
Объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной 0,17 ± 0,1мм. Если стекло не соответствует стандарту, необходимо регулировать объ- ектив вращением кольца коррекционной оправы, которой оснащены совре- менные высококачественные объективы. При отсутствии такой оправы сфери- ческую аберрацию, вызываемую покровным стеклом, следует устранить, под- нимая или опуская тубус микроскопа (Теппер и др., 1993).
Одной из важных характеристик объектива является разрешающая способность, определяющая в конечном итоге разрешающую способность микроскопа в целом. Она определяет наименьшее расстояние между двумя точками на препарате, которые будут видны раздельно. Разрешающая спо- собность объектива (d) зависит от его числовой (численной, или нумери- ческой) апертуры (А) и длины волны света (?), при которой идет наблюде- ние объекта:
d = ? / A Длина волны света, воспринимаемая человеческим глазом, составляет 0,4...0,7мкм. Отсюда среднее значение ? = 0,55мкм.
При определении разрешающей способности микроскопа следует раз- личать два случая: освещение прямое (лучи падают параллельно оптиче- ской оси микроскопа) и косое. При косом освещении разрешающая спо- собность микроскопа бывает в два раза меньше, чем при прямом:
d = ? / 2A Предел разрешающей способности объектива или наименьшее значе- ние величины d можно представить следующим образом. Пусть значение ? – наименьшее (для более коротких, чем видимые, ультрафиолетовых лучей оно равно 350нм), а значение А – максимальное (в наиболее совершенных иммерсионных системах 1,4...1,6). В этом случае разрешающая способ- ность объектива будет наибольшей по физическому смыслу и наименьшей по абсолютной величине.
При обычных условиях работы с микроскопом величина ? постоянна, так как объекты исследуются при обычном свете (? – 0,55мкм). Следова- тельно, предел разрешающей способности зависит исключительно от воз- можности повышения числовой апертуры. Числовая апертура объектива ха- рактеризует его светособирающую способность и определяется по формуле:
А = n?sin1/2?, где n – показатель преломления светового луча, проходящего через предметное стекло в среду между фронтальной линзой объектива и пред- метным стеклом;
? – угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, другая образована линией, соединяющей точку выхода эффективных лучей из объектива с границей действующего отверстия объектива;
1/2? – половинный угол входного отверстия объектива. Важно, чтобы значение величины n было максимальным. Повысить ее можно введением в промежуток между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом среды с показателем преломления, близким к показа- телю преломления стекла. На практике это достигается использованием иммерсионных объективов с введением кедрового масла (n = 1). Дальней- шего повышения n можно достичь введением среды с показателем пре- ломления более высоким, чем у стекла.
Важно также, чтобы значение величины sin1/2? было максимальным. Чем больше sin1/2?, тем выше числовая апертура и разрешающая способ- ность объектива. Предел повышения sin1/2? зависит от степени кривизны фронтальной линзы (это учитывается при изготовлении иммерсионных объективов) и числовой апертуры конденсора.
Высокоапертурные объективы применяют только одновременно с вы- сокоапертурным конденсором. Если апертура конденсора меньше аперту- ры объектива, то возможности последнего оказываются не полностью ис- пользованными (Теппер и др., 1993).
Следует помнить, что повысить величину sin1/2? при использовании им- мерсионных объективов можно максимальным поднятием конденсора, что определяется светособирающей функцией данного приспособления. Посколь- ку его линзы короткофокусные, световые лучи фокусируются конденсором на близком расстоянии, т.е. предусматривается фокусировка в плоскости объекта. Если конденсор опущен, его функция, по существу, нарушается.
В свою очередь, окуляр микроскопа служит непосредственным про- должением "линз" человеческого глаза. Преломляющую систему глаза можно рассматривать как двояковыпуклую линзу со средним фокусным расстоянием 15см (расстояние наилучшего зрения 25см). Тесная связь с глазом человека отражена в названии окуляра (от греч. «oculus» – глаз). Окуляр состоит из двух линз – глазной (верхней) и полевой, или собира- тельной (нижней), заключенных в металлическую оправу. Назначение по- левой линзы – собирать лучи, идущие от объектива, таким образом, чтобы они проходили через маленькое отверстие глазной линзы.
Назначение окуляра – в прямом мнимом увеличении действительного обратного и увеличенного изображения, которое дает объектив. Увеличе- ние окуляра выгравировано на оправе. Рабочее увеличение окуляров ко- леблется в пределах от 4? до 15?. Собственное увеличение окуляра вычис- ляют по формуле, применяемой для определения увеличения луп:
K = L / F, где L – расстояние наилучшего зрения, равное 25см; F – фокусное расстояние линз окуляра.
Окуляры бывают различных типов. Выбор их зависит от объектива. С ахроматическими объективами малых и средних увеличений и планахро- матами малых увеличений применяют окуляры Гюйгенса или ортоскопи- ческие окуляры; с апохроматическими, планахроматическими и ахромати- ческими объективами больших увеличений – компенсационные окуляры.
Окуляры Гюйгенса состоят из двух плоско-выпуклых линз, обра- щенных выпуклой стороной к объективу. Нижняя линза обычно имеет больший диаметр и большее фокусное расстояние, чем верхняя. Фокальная плоскость окуляров Гюйгенса располагается между глазной линзой и лин- зой поля зрения.
При длительной работе с микроскопом следует пользоваться двойны- ми окулярами – бинокулярной насадкой. Бинокулярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5?) и снабжены коррекционными линзами. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55...75 мм в за- висимости от расстояния между глазами наблюдателя. Работа с биноку- лярной насадкой улучшает видимость объекта, снижает яркость изображе- ния и тем самым сохраняет зрение (Теппер и др., 1993).
