5.4. Оборудование и материалы

5.4.1. Микроскопы

При исследовании водорослей наиболее часто используются биноку- лярная лупа и инвертированный микроскоп, хотя комбинированные мик- роскопы также используются. В хорошо оборудованной лаборатории мо- гут использоваться все виды оптических приборов, каждый для своих це- лей. Бинокулярная лупа должна иметь хорошие оптические линзы, лучше всего с увеличением по крайней мере до 80?. Освещение, возможно, явля- ется наиболее важным аспектом при работе с бинокулярной лупой. Транс- миссионная иллюминация и иллюминация темного поля в этом случае да- ют хороший результат. Освещение по методу темного поля лучше транс- миссионного света, так как позволяет выделять более мелкие клетки. Под- светка Шотта с оптико-волоконным источником света и освещением тем- ного поля является превосходным дополнительным модулем. Крошечные клетки, пылинки и бактерии ярко освещаются на темном фоне, и видны так же, как и при большом увеличении. Свет, пропущенный через флуорес- центную лампу или исходящий от другого источника света, тоже подхо- дит, если зеркало предметного столика приспособлено к вращению во всех направлениях для улавливания света.

Инвертированный микроскоп должен иметь конденсор с большим рабочим расстоянием для обеспечения легкого доступа при использовании микропипетки. Инвертированные световые микроскопы, особенно последние модели, имеют преимущества для легкой изоляции и наблюдения, обеспечивая детальное изображение нужных объектов. К сожалению, мик- роскопы, произведенные до 1990 года, плохо подходят для этих целей. Наиболее часто используются оптические линзы с увеличением 4?, 10?, 20? и 40?. При работе с инвертированным микроскопом могут использо- ваться разные виды чашек или стекол, но этот микроскоп превосходит другие микроскопы по легкости работы с пластиковыми планшетами. По- этому дизайн рабочего столика крайне важен для работы. Обогащенные культуры в пластиковых планшетах («multiwell plates») и изоляты одиноч- ных клеток можно эффективно изучить с помощью инвертированного микроскопа; клетки могут быть изолированы прямо из гнезд.

Инвертированный микроскоп с флуоресцентным освещением явля- ется хорошим инструментом для определения и выделения цист из осев- ших образцов, поскольку клеточные стенки и хлорофилл могут обеспечи- вать флуоресцентный сигнал. Многие «цветущие» виды (например, рафи- диофиты, диатомовые, динофлагелляты) были выделены в культуру имен- но путем изоляции их цист из осадков (Andersen et al., 1995).

Комбинированные микроскопы могут быть более сложны в экс- плуатации, чем бинокулярная лупа и инвертированный микроскоп. Рабочее расстояние между линзами объектива и образцом у них малo, что делает сложным отбор клеток с помощью микропипетки. Кроме того, многие составные микроскопы переворачивают изображение, за- трудняя процесс выделения. Но на таких моделях могут устанавли- ваться реверсные призмы, которые позволяют облегчить работу. Су- ществует много разных типов комбинированных микроскопов, но да- же самые простые микроскопы, используемые для образовательных целей, имеют достаточное рабочее расстояние, позволяющее провести процедуру выделения водорослей (30мм для объективов с увеличени- ем 4?, 8мм для линз 10? и 3мм для линз 20?, Olympus CH-2). Они имеют такую же разрешающую способность, как и инвертированные световые микроскопы, или даже лучше. Более того, простые комбини- рованные микроскопы популярнее и дешевле инвертированных мик- роскопов. Простая структура комбинированного микроскопа делает установку и разборку достаточно легкой, что является важным пре- имуществом во время полевых экспедиций. Если используется линза для водной иммерсии с увеличением 40?, препарат можно смотреть на большом увеличении без покровного стекла. После того, как положе- ние клетки определено, для выделения водоросли может быть исполь- зована линза для маленького увеличения.

Комбинированный микроскоп может быть также очень полезным для проверки выделения одной клетки. Например, если крошечная клетка была выделена и помещена в стерильную каплю на предметное стекло с помощью бинокулярной лупы, потом ее можно изучить при гораздо большем увеличении на комбинированном микроскопе. В этом случае комбинированный микроскоп позволяет исследователю разли- чить несколько похожих типов клеток, а также проверить наличие клетки-загрязнителя. Фазово-контрастный микроскоп также может быть полезен для определения загрязнителя. Например, объективы 10? и 20? микроскопа Olympus CH-2 дают псевдо изображение темного по- ля, когда свет конденсора соответствует свету, предназначенному для объектива с увеличением 100?(Andersen, Kawachi, 2005).

5.4.2. Фильтры и сита

Сита, сети или фильтры используются для отделения ненужных час- тиц на две фракции по размеру, хотя форма частиц также влияет на про- цесс фильтрации.

Мембранные фильтры относятся к двум основным типам. Один тип фильтров состоит из переплетенных органических нитей (например, ацета- та целлюлозы), которые имеют многочисленные отверстия (фильтры «из- вилистой дорожки»). Такие фильтры имеют поры диаметром менее 0,01мкм. Кроме того, они выпускаются с размерами пор 0,45, 0,2, или 0,1мкм. Фильтры этого типа изготавливаются при помощи собранного на электроде серебра (Flotronics, Flotronics, Inc.) и анодного алюминия (Ano- pore, Whatman, Inc.).

Другой тип мембранных фильтров представляет собой тонкие, пло- ские листы из поликарбоната, имеющие круглые отверстия примерно оди- накового диаметра, расположенные случайным образом. Иногда два или три отверстия накладываются друг на друга. Данные фильтры лучше всего подходят для применения в фикологии. Второй тип фильтра предназначен для разделения фракций двух разных размеров, поэтому эти фильтры луч- ше соответствуют идеальному ситу, чем фильтры из органических нитей. Установлено, что используемые фильтры обоих типов с номинальным размером пор 0,2мкм, имеют многочисленные дефекты поверхности, кото- рые видны с помощью электронной микроскопии. Частички грязи и водо- росли размером несколько микрометров были обнаружены в фильтратах. Фильтры задерживали 92,5% частиц размером больше 0,1мкм, но они про- пускали более мелкие частицы, включая гетеротрофные бактерии и пико- фитопланктон (Andersen, Kawachi, 2005).

Лучше фильтровать небольшой объем водорослей, останавливая процесс, если фильтрация замедляется. Фильтр не должен высохнуть, жидкость, собранная над поверхностью фильтра, должна быть перенесена в стерильный сосуд. Фильтры с отверстиями большего диаметра могут ис- пользоваться, если первая фильтрация дает слишком мало клеток, или ис- пользуется комбинация из нескольких фильтраций. Если фильтрат содер- жит только один вид водорослей, отфильтрованные клетки могут быть сразу же перенесены непосредственно в питательную среду. Однако в боль- шинстве случаев для выделения водорослей необходимо применение ме- тодов, описанных ниже.

Дифференциальная фильтрация также может использоваться для удаления дрожжей или других водорослей из образцов или накопительных культур. Нити грибов хорошо удерживаются фильтрами, однако их споры обычно проходят вместе с водорослями. Для уменьшения или удаления спор грибов можно добавить небольшое количество солодового экстракта или другого органического вещества. Споры грибов могут прорастать в те- чение 1-2 дней, образуя нити, которые можно собрать на фильтре до их нового прорастания (Andersen, Kawachi, 2005).

5.4.3. Посуда

До недавнего времени для выделения водорослей использовалась исключительно стеклянная посуда, сейчас ее часто заменяют пластико- вой, одним из преимуществ которой является стерильность, обеспечи- ваемая ее хранением в стерильных пакетах, готовых для использования. Другим достоинством пластика является то, что посуда для культиви- рования обрабатывается субстанциями, способствующими росту мно- гих видов водорослей. При выделении водорослей используются про- бирки, чашки Петри, чашки Петри, разделенные на квадраты, часовые стекла, микропипетки Пастера, капиллярные трубки, предметные стек- ла, колбы и другая посуда (рис. 13).

Для выделения крупных водорослей принадлежности можно сте- рилизовать автоклавированием, однако для выделения очень мелких и трудных для выделения клеток необходимо использовать стерилизацию сухим жаром.

Неважно, какая посуда используется для выделения водорослей (стеклянная или пластиковая), главное, чтобы она была готова к началу процесса выделения. Все материалы должны быть упакованы для со- хранения стерильности, их лучше всего содержать в стерильном ящике или пакетах. Кроме посуды, перечисленной выше, исследователь дол- жен иметь запас стерильных крышек. Для отбора почвенных образцов необходимо иметь стерильную лопаточку и стерильную установку для фильтрования. Необходимо также иметь в наличии этикетки для запи- сей, а для запечатывания чашек Петри и пластиковых планшет – пара- фильм. Наконец, нужно иметь запас чистых бумажных салфеток для протирания поверхностей.

73

Рис. 13. Посуда и оборудование для выделения водорослей (Andersen, Ka- wachi, 2005): a - сита для удаления животных и крупных водорослей; b - стеклянные и пластиковые чашки Петри; с – пластиковые планшеты; d - шприц с фильтром с диаметром отверстий 0,2мкм; e –микропипетка с до- затором; f - маленькая лупа, микробиологическая петля и пинцет; g - пи- петки Пастера, установленные на металлической стойке; h – стерильные пипетки Пастера в пластиковом футляре; i - стеклянная трубочка, малень- кий шланг и соединительная трубка; j - мундштук для соединения шлангов во время изоляции, маленький соединительный шланг для пипетки Пасте- ра; k – большой соединительный шланг с наконечниками пластиковой пи- петки на обеих концах, один конец служит мундштуком, другой поддер- живает пипетку Пастера; l - мундштуки и два наконечника пластиковых пипеток, которые могут быть использованы как мундштуки; m - стеклян- ная планшета, которая может быть использована для споласкивания клеток во время выделения; n - маленький аппарат для фильтрования; o - стеклян- ные пробки как для гладких пробирок, так и пробирок с резьбой для кры- шек; p - гладкие стеклянные пробирки со стеклянными пробками; q - про- бирки со специальной резьбой для крышек; r – стерильные пробки для пробирок; s – пластиковые пробирки с крышками, стерилизованные про- мышленным способом; t - стерильные колбы для культивирования с крышками.

5.4.4. Камеры для выращивания водорослей

Для выращивания водорослей широко используют специальные камеры. Особенно тщательно следует подходить к выбору источника света. В настоящее время появились флуоресцентные лампы, излу- чающие полный световой спектр, близкий к естественному освеще- нию. Следует избегать слишком яркого света. Если нет возможности приобрести специальную камеру для культивирования, можно исполь- зовать северное окно. Увеличение интенсивности света часто не при- водит к усилению роста одноклеточных изолятов и наносит вред куль- турам. Большинство культур требуют освещенности 30-60?моль?м- 2?с-1, однако условия освещения могут различаться для организмов из экстремальных местообитаний. Для культивирования некоторых водо- рослей необходима темнота. Поэтому для вновь выделенных водорос- лей необходимо сначала попробовать выращивание в темноте, и толь- ко тогда, когда станет ясно, что им необходим свет, водоросли следует выращивать на свету. Для выращивания большинства водорослей ис- пользуют циклы свет/темнота 12:12 или 16:8, хотя некоторые зимние штаммы требуют более длительного периода темноты (например, Has- lea) (Andersen, Kawachi, 2005).