4.4. Способы стерилизации
4.4.1. Автоклавирование
Автоклавирование является наиболее эффективным и популярным способом стерилизации жаропрочных материалов и обычно используется для стерилизации жидкостей. Автоклав является специальным аппаратом, состоящим из котла с толстыми стенками, внутри которого происходит высокотемпературная стерилизация благодаря высокому давлению (см. рис. 4). На массивной крышке или сбоку котла есть кран для выхода пара, манометр и предохранительный клапан. Манометр показывает, насколько давление пара внутри котла выше нормального атмосферного. Для предот- вращения взрыва при превышении предельного давления предохранитель- ный клапан устанавливают так, чтобы дать выход пару.
Рис. 4. Схема автоклава (Теппер и др., 1993) Примечание: 1 - воронка, через которую автоклав заправляют водой; 2 - предохранительный клапан; 3 - монометр; 4 - крышка автоклава; 5 - водо- паровая камера; 6 - кран для выпуска воздуха; 7 - отверстие, через которое пар поступает в стерилизационную камеру; 8 - стерилизационная камера; 9 - подставка для размещения стерилизуемых материалов
49
Показателям манометра в физических атмосферах соответствует опреде- ленная температура (табл. 2). Обычно автоклавирование проводят при температуре 120°С и давлении 1атм в течение 20 минут.
Таблица 2 Температура стерилизации и давление в автоклаве (Теппер и др., 1993)
Давление, атм Температура, ?С
0,5 1,0 1,5 2,0
115 120 127 133
Стерилизацию ведут следующим образом. Наливают воду в авто- клав, помещают в него стерилизуемые предметы, завинчивают крышку и начинают подогрев. Кран оставляют открытым до тех пор, пока весь воз- дух, находящийся в автоклаве, не будет вытеснен парами воды. Когда пар начнет выходить из крана непрерывной струей, кран закрывают, доводят давление пара в автоклаве до 1атм и поддерживают на этом уровне 20-30 минут. Затем нагрев прекращают, ждут, пока стрелка манометра дойдет до 0, осторожно открывают кран и спускают пар. Только потом отвинчивают крышку автоклава. Если кран будет открыт раньше, чем упадет давление, то жидкость в стерилизуемых сосудах закипит и вытолкнет из них пробки.
Для контроля за работой автоклавов среди стерилизуемых предметов можно закладывать специальные тесты-ампулы, содержащие химические вещества, которые плавятся при определенной температуре. Например, у бензонафтола температура плавления 110°С, у антипирина - 113°С.
Автоклав используют и для дробной стерилизации текучим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы дать свободный выход пару (Теппер и др., 1993).
Продолжительность процедуры зависит от объема стерилизуемой жидкости. Например, автоклавирование в течение 10 минут при темпера- туре 121°С достаточно для стерилизации пробирок диаметром 18мм, в то время как для стерилизации 10л жидкости необходим 1 час. При соблюде- нии всех правил, процедура позволяет уничтожить все микроорганизмы, даже устойчивые к высоким температурам споры бактерий и грибов. При автоклавировании поверхность и внутренние части стерилизуемых мате- риалов увлажняются. Поэтому после завершения процесса в большинстве случаев необходимо высушивание в автоклаве при помощи специального сухого режима или в сухожаровом шкафу при температуре 150°С.
При автоклавировании необходимо соблюдать некоторые меры предосторожности. Для жидкостей важно оставлять свободное про- странство в емкости (колбе или пробирке), равное по крайне мере од- ной четвертой части объема сосуда, с учетом образования пара и ки- пения жидкости. Перед началом процесса необходимо ослабить закру- чивающиеся крышки с пробирок для предотвращения разрушения в результате высокого давления.
Для этикетирования сосудов для автоклавирования необходимы стойкие к высокому давлению и температуре материалы. Можно ре- комендовать использование специальной ленты. На этикетке необхо- димо указать дату. После завершения процедуры необходимо закру- тить крышки пробирок.
Если необходимо предотвратить загрязнение следовыми количе- ствами тяжелых металлов, нужно использовать другие методы стери- лизации (Price et al., 1989).
4.4.2. Стерилизация сухим жаром
Этот метод стерилизации применяют для обработки посуды и сухих материалов (но не жидкостей!). Стерилизация сухим жаром позволяет уст- ранить недостатки автоклавирования и также используется для высушива- ния пробок в пипетках. Стерилизация сухим жаром требует более высокой температуры, чем стерилизация автоклавированием. Самый строгий метод требует нагревания до 250°С в течение 3-5 ч, однако в большинстве случа- ев, достаточно нагревания до 150°С в течение 3-4 ч.
Для этого метода стерилизации чаще всего используют печь Пастера (рис.5).
Рис. 5. Оборудование для стерилизации. Печь Пастера (Теппер и др., 1993)
При использовании этого метода необходимо соблюдать меры пре- досторожности. Температура в разных частях сухожарового шкафа может быть выше, чем указано на градуснике, что может привести к разрушению материалов. Стерилизуемая посуда должна быть сухой и завернутой в спе- циальные материалы (например, в алюминиевую фольгу) или помещена в специальный контейнер (например, в коробку из нержавеющей стали или стеклянную емкость). После окончания стерилизации не следует сразу же открывать двери шкафа, так как возможно загрязнение материалов в ре- зультате конвекции воздуха (Karachi, Noel, 2005).
4.4.3. Пастеризация и тиндаллизация
В XIX веке Д.Тиндалл и Л.Пастер разработали (для других целей) процедуры для кипения растворов, сходные со стерилизацией пищи. В дальнейшем эти процессы стали называть пастеризацией и тиндаллиза- цией. Фикологи адаптировали и модифицировали эти методы для жид- костей, которые нельзя нагревать выше 100°С или автоклавировать. Высокая температура достигается с помощью пара без давления, по- этому пропаривание часто используется в фикологии. Э.Прингшейм (Pringsheim, 1946) рекомендовал пропаривание для приготовления двухфазных почвенно-водных сред. Кроме того, пропаривание часто используется для приготовления обогащенных сред на основе морской воды. Существуют различные модификации этого метода, хотя нет их четкого определения. Метод пропаривания можно определить как ме- тод нагревания жидких растворов до высокой температуры и сохране- ния этой температуры в течение некоторого промежутка времени, по- сле которого следует быстрое охлаждение.
При пастеризации жидкость нагревается до температуры 66-80°С, выдерживается при этой температуре не менее 30 минут и после этого быстро охлаждается до температуры меньше 10°С (рис. 6).
При тиндаллизации процесс схож со стерилизацией: в первый день материалы остаются охлажденными до следующего дня, потом они снова нагреваются и охлаждаются, и цикл повторяется на третий день (рис. 6). Повторение процесса позволяет уничтожить цисты, кото- рые прорастают после первого или второго цикла нагревания.
В аквакультуре, когда используются большие емкости с пресной или морской водой, используют краткосрочную стерилизацию. Полу- чают пар (часто с помощью домашней печи), который пропускают ме- жду титановыми тарелками для обмена тепла. Морская или пресная во- да проходит между тарелками, где она нагревается до 70°С. Эта проце- дура не уничтожает самые устойчивые споры, но убивает большинство живых организмов в воде (Kawachi, Noel, 2005).
52
Рис. 6. Схематическое сравнение процессов пастеризации и тиндаллизации (Kawachi, Noel, 2005)
4.4.4. Стерилизация фильтрацией
Стерилизация фильтрацией используется для неустойчивых компо- нентов, таких как витамины, или изменчивых компонентов жидкостей, та- ких как органические растворители. Этот метод также используется для удобства и быстроты, когда требуется стерилизация небольшого объема жидкости. Существует большое разнообразие фильтров, различающихся размером пор, составом, цветом и размером. Для стерилизации питатель- ных сред обычно используются мембранные фильтры, которые могут под- вергаться автоклавированию. Диаметр пор должен быть менее 0,2мкм, од- нако необходимо отметить, что вирусы могут проходить через отверстия этого диаметра. Если раствор имеет высокую вязкость или содержит взве- шенные частицы, необходима предварительная фильтрация через фильтр с диаметром пор 1мкм. В настоящее время в продаже имеются как одноразо- вые фильтры, так и фильтры для многоразового использования. Стерильные одноразовые фильтры удобнее, но они относительно дороже. Обору- дование для многоразовой фильтрации (стеклянные или поликарбонатные материалы) необходимо автоклавировать, мембранные фильтры и сопутст- вующие материалы необходимо помещать в специальные мешки или заворачивать в алюминиевую фольгу. После автоклавирования наборы для фильтрации необходимо высушить в сухожаровом шкафу при температуре 120°С. После остывания фильтра процесс фильтрации можно проводить на лабораторном столе, если резервуар с отфильтрованной жидкостью сте- рильно закрыт. После фильтрации необходимо перелить чистые растворы в стеклянные емкости с соблюдение условий стерильности.
Для очень маленьких объемов жидкости используют специальные стерильные шприцы с одноразовыми фильтрами, однако возможно ис- пользование и оборудования с многоразовыми фильтрами. Одноразовые фильтры можно использовать сразу же, в то время как многоразовые фильтры требуют предварительной очистки.
При использовании метода фильтрации следует обратить внимание на то, что мембранные фильтры, изготовленные из переплетенных органи- ческих нитей или перфорированных поликарбонатных листов, иногда имеют отверстия большего диаметра, чем номинальный размер пор. На- пример, установлено, что фильтры с размером пор 0,2мкм имеют много- численные дефекты поверхности, обнаруживаемые с помощью электрон- ного микроскопа, и в фильтрате обнаруживаются водоросли и посторонние частицы диаметром несколько микрометров. Маленькие гетеротрофные флагелляты могут сжиматься при прохождении пор, которые намного меньше обычного размера их клеток (Kawachi, Noel, 2005).
4.4.5. Стерилизация с помощью микроволновой печи
Стерилизация при помощи микроволновой печи быстрее, чем про- паривание или сухая стерилизация. Микроволновая печь производит те- пло двух видов: ионная поляризация и дипольная ротация. На практике, клетки скорее погибают от пара во время кипения, чем от воздействия микроволн, в настоящее время негативное воздействие микроволн на живые организмы еще не доказано (Keller et al., 1988). Стерилизация в микроволновой печи эффективна и нетоксична. Рекомендуется исполь- зовать микроволновую печь, которая снабжена вращающейся подстав- кой и имеет мощность до 700Вт.
Существует несколько методик стерилизации жидкостей в микро- волновой печи. Например, при стерилизации 1-1,5л морской воды, микро- водоросли погибают в течение 5мин, бактерии – 8мин, грибы – 10мин. (Keller et al., 1988). В настоящее время микроволновые печи имеют бoльшую мощность, поэтому время стерилизации будет зависеть от мощ- ности прибора. Кроме того, эффективность микроволновой печи уменьша- ется с течением времени, и поэтому при стерилизации в старых печах этот процесс нужно проводить дольше. Существует и методика быстрой стери- лизации в течение 5мин (стерилизация в течение 1,2 и 2 минут с интерва- лами в 30секунд) при 600Вт (Leal et al., 1999).
Для стерилизации стеклянной посуды необходимо налить небольшой объем дистиллированной воды в посуду и стерилизовать в микроволновой печи в течение 20 минут при 600Вт (Boye, van den Berg, 2000). После сте- рилизации воду нужно вылить в ламинарном шкафу с соблюдением правил стерильности. Если в посуду не добавляется вода, необходима стерилиза- ция в течение 45 минут или дольше для уничтожения спор бактерий, что аналогично разнице времени стерилизации в автоклаве и сухожаровом шкафу (Kawachi, Noel, 2005).
4.4.6. Стерилизация с помощью ультрафиолетового облучения
Хотя x-лучи и ?-лучи (ионизирующая или ультрафиолетовая (УФ) радиация) широко используются в промышленных целях (например, для стерилизации пластиковой посуды), эти методы можно также использовать и в лабораторных условиях. УФ-радиация подходит для использования в лаборатории, включая стерилизацию ламинарных боксов и рабочих по- верхностей. УФ-радиация опасна для человека (особенно для глаз), и необ- ходимо избегать попадания этих лучей на тело. Вдобавок, УФ-радиация образует озон, что также нежелательно для человека. УФ-радиация имеет первичный летальный эффект при 260нм и способствует образованию ко- валентных связей в тимине ДНК. Эти димеры тимина вызывают ошибки при удвоении ДНК и приводят к возникновению потенциально летальных мутаций.
Ультрафиолетовые лампы испускают излучение с длиной волны от 240 до 280нм. Энергия зависит от размера лампы и колеблется от 40 до 40000мкВт?с/см2. Выбор лампы зависит от ее назначения. УФ-радиация не проникает через обычное стекло, поэтому для стерилизации жидкостей, особенно в больших объемах, рекомендуется использовать водостойкие пригодные для использования под водой лампы. Стеклянную посуду мож- но заменить на кварцевую, которая пропускает УФ-лучи, однако такая по- суда стоит очень дорого. Кроме того, кварцевое стекло легко царапается, что снижает его эффективность. При стерилизации больших объемов воды следует помнить, что ультрафиолетовый свет не проходит сквозь воду одинаково – он абсорбируется, и его эффективность снижается по мере удаления от лампы. Постоянное перемешивание воды и достаточное время экспозиции позволяет решить эту проблему, однако если организмы при- крепляются к внутренней части емкости, последующая стерилизация мо- жет быть неэффективной без использования более мощной лампы и более длительного времени экспозиции (Kawachi, Noel, 2005).
4.4.7. Стерилизация с использованием отбеливателя
Отбеливатель (гипохлорит натрия) широко используется в аквакуль- туре водорослей, где требуется стерилизация больших объемов воды. Хотя добавление небольшого количества отбеливателя не может убить все цис- ты, это позволяет избавиться от большинства организмов. Количество до бавляемого отбеливателя зависит от органических веществ в воде. Обычно добавляют 1-5мл отбеливателя в промышленной концентрации на 1л воды, и после легкого перемешивания воде дают отстояться в течение несколь- ких часов. При отстаивании в течение более короткого промежутка необ- ходимо добавлять больше отбеливателя. Раствор не следует выставлять на прямой солнечный свет. После окончания обработки раствор нейтрализу- ют тиосульфатом натрия (Na
2
S
2
O
3
?5H
2
O). Берут 50г тиосульфата натрия, растворяют в 1л воды, затем 1мл этого раствора добавляют к 4мл исполь- зуемого отбеливателя (Kawachi, Noel, 2005).
4.4.8. Стерилизация с помощью оксида этилена
Раньше неустойчивые к нагреванию материалы (пластики и каучуки) стерилизовали с помощью оксида этилена. Однако в этом случае проблемы возникали после стерилизации, так как оставались следы этого химиката, часто убивающие живые клетки. Постепенно этот способ стерилизации вышел из употребления. В настоящее время используются устойчивые к нагреванию или одноразовые стерильные материалы (Kawachi, Noel, 2005).
