БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НЕКОТОРЫХ ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ, АВТОТРОФНЫХ ГЕТЕРОТРОФНЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ, ВЫРАЩЕНЫХ В НЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРЕ
Метод непропорционально-проточного культивирования позволяет получать ежесуточно до 0,5 г/л биомассы моин и дафний, около 20 г/л биомассы коловраток пинфузорий и использовать ее для различных исследований.
в литературе имеются даніые по качественному аминокислотному составу p. caudatum (Lee, 1956) и Tetraliymenidae [Hamilton е. а., 1952. Количественный состав свободных аминнокислот исследован у нескольких видов амеб [Friz, 1968, у E. gracilis [Miller, 1976).
Для определения общего биохимического состава водНЫХ беспозвоночных многие авторы [Маликова, 1956; Степалова, 1967, 1968; Albrecht, 1969; Богатова и др., 1971) использовали биомассу водных беспозвоночных, выловленных из прудов и рек, а также на Толиэтиленовых панцирные Коловратки Br. ca
103
luciflorus) или сетчатых капроновых (ветвистоусые рачки) садков (Богатова и др., 1971; Богатова, 1973).
Во-первых, полученная из природы биомасса неоднородна, Во-вторых, не ясно, какой корм использовали беспозвоночные в природных водоемах и садках, расположенных в водоемах. в литературе имеются данные общего биохимического состава Ph. acuticornis odiosa, выращенных в лабораторных условиях [Meadow е. а., 1971). Біомасса коловраток содержала (в % ): сырого протеина — 43-54, жира – 14—24 (у старых коловраток количество жира увеличивалось), золы — 6,9 и РНК у молодых - 5,6 и у старых - 1,7.
Цель наших исследований - установить количественный аминокислотный состав белка инфузорий, коловраток и ветвистоусых рачков и сравнить его с таковым фотосинтезирующей водоросли (Chlorella vulgaris), хемосинтезирующих водородных бактерий (Hydrogenomonas) и гетеротрофных микроорганизмов - дрожhеії, а так?е продукта якивотного происхождеІІІЯ -- Казена.
Определен количественный биохимический состав Р. caudatum, выращенных в непрерывной непропорционально-проточной культуре Кокова и др., 1973).
Клопальную культуру тарамецийї содержали на среде Лозина-Лозинского с рН 6,8, кормом слуысила смесь дрожжей Saccharomyces ellipoides и бактерий Bacillus subtilis, Слитую часть культуры парамеций оставляли без корма в течение 12 ч. За это время они полностью выедали дрожжевой корм. От бактерийї культуру отмывали 3 раза по 2-3 мин центрифугированием при 1000 об./мин. Нике дан биохимический состав Лиофильно высушенных Paramecium caudatum (в % ):
Сыројї протеин . . . . . Связанные жиры . . , Свободные жиры . . . Уr:1еводы . . . . . . Зона . . . . . . .
58, 1 11.8 193 4,0
Эти данные близки к полученным ранее [Grobicka, Wasilewska, 1925). Аминокислотный состав различных одноклеточных определяли методом одномерной нисходящей хроматографии на бумаге [Андреева, Кокова, 1974]. В табл. 11 и 12 представлены экспериментальные данные по аминокислотному составу биомассы и белка парамеций и Bl. rеdulans. Кроме этого, приводится аминокислотный состав фотосинтезирующей водоросли хлореллы и хемосинтезирующих водородных бактерий Hydrogenomonas, выращенных в условиях интенсивного непрерывного культивирования Терсков и др., 1964, 1969].
Биомасса всех одноклеточных организмов содержит полІный набор незаменимых аминокислот. У ненакормленных парамецийї количество аминокислот уменьшается по сравнению
Таблица 11 Аминокислотный состав биомассы инфузорий, хлореллы, водородных бактерий казенна, а на сух. в-но
с хорошо накормленными за счет лизина, гистидина, аргинина, серина, глицина, глютаминовой кислоты, метионина -- валина. Анализ биомассы блефаризм показал более низкий сумма рный аминокислотный состав по сравнению с парамеЦИЯМИ.
В табл. 12 приведены данные аминокислотного состава белка парамеций, хлореллы и водородных бактерий, рассчитанные по ранее приведенным результатам, в сравнении с белком жиВотного происхождения — казеином. Во всех образцах отмечено высокое содержание незаменимых аминокислот (39—40%). Белок парамеций по ряду аминокислот (глютаминовая, лейцины, изолейцины) стоит ближе к животному белку — казеину, чем к белку фото- и хемотрофов.
Помимо одноклеточных организмов нами совместно с В. А. Барашковым и И. Н. Трубачевым исследован биохимический состав многоклеточных водных беспозвоночных, выращенных в непропорционально-проточной культуре. В качестве объекта исследования использованы беспанцирные Коловратки (низшие черви) Ph. acuticornis odiosa и ветвистоусые рачки М. macrocopa. Для корма им взяты дрожжи Saccharomyces ellip
Таблица 12 Аминокислотный состав белка парамеций, хлореллы, водородных бактерий и казеина, % на белок
soides, дрожжи прессованные S. cerevisiae и хлорелла Chlorellia vulgaris. В некоторых опытах использован смешанIIыії корм: хлорелла - дрожки Saccharomyces ellipsoides (A) и хлорелла + прессованные дрожжи (Б). Соотношение компонентов в смеси 1:1
Коловраток отделяли от среды центрифугированиемя, а мои-- с помощью капроновой сетки. Биомассу сушили при 105°С и использовали для анализов. Содержание сырого протеина рассчитывали умножением общего азота, определяемого по Кьельдалю на коэффициент 6,25, углеводы — антроновым методом, фракции углеводов — по методике А. Н. Белозерского и Н. И. Проскурякова (1951), нуклеиновые кислоты — по А. С. Спирину (1958). Для установления аминокислотного состава образцы предварительно гидролизовались бн, соляной кислотой при 110C в течение 22 чв запаянных ампулах. Цистин и метионин определяли после окисления биомассы надмуравьиной кислотой и последующего гидролиза в запаянных ампулах 6 н. соляной кислотой в течение 18 ч. Содержание аминокислот в гидролизатах находили на автоматическом ана -
лизаторе KLA-3B («Хитачи»).
В табл. 13 представлены данные по биохимическому составу. Коловраток и моин. Основным биохимическим компонентом являются белки, их количество составляло 50 — 60 % сухого
Таблица 13 Биохимический состав коловраток нмонн, 9% на абс. сух. В-во
веса биомассы (см. табл. 10), что согласуется с литературными данными (Маликова, 1956; Степанова, 1968; Богатова и др., 1974 1.
В биомассе коловраток отмечено низкое содержание трудногидролизуемых полисахаридов — 0.4. Количество 30лы по сравнению с панцирными коловратками |Богатова и др., 1971) снизилось на 1% и равнялось 5%.
вбиомассе мои трудногидролизуемые углеводы составили 0,5—0,6, зоtа — 5,8%. Из литературы известно, что количество золы в биомассе ветвистоусых рачков может колебаться от 7,6 (молодь цериодафний) до 38,1 % (биомасса взрослых дафний из пруда) (Богатова и др., 1971] и зависит не только от возраста популяции, но и от условий выращивания. В биомассе дафний, выращиваемых в условиях систематического кормлеНия, золы было лишь 9,9 % (Богатова, 1973а. Использованный на ми метод непрерывного культивирования создает условия для непрерывного роста культуры, в которой находится много молодых организмов, что вероятно, обеспечивает получение биомассы моин с низким содержанием золы — около 60. Количество жира в биомассе Коловраток и моин, определенное по разности, составило значительную величину (24—26 %). Из литературы известно [Meadow е. а., 1971), что концентрация жира в биомассе коловраток Ph. acuticornis odiosa колеблется от 14 (в возрасте 5,5 сут) до 24% (9,5 сут) и далее пе изменяется. Вероятно, в наших опытах в биомассе преобладали коловратки не моложе 8— 10-суточного возраста. Основное небелкоВое азотистое вещество беспозвоночных – нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК). Накопление этих компонентов за висит от природы организма, физиологического состояния, главным образом скорости роста. Из литературы известно (Meadow е. а., 1971), что в биомассе исследованных нами коловраток содержание РН? колеблется от 1,7% у старых особей (20 сут и более) до 5,6 % у молодых (4, 5 сут). Известно, что коловратки Ph, acuticornis наиболее активно растут до 10)-суточного воз
Таблица 14 Аминокислотный состав коловраток и моин в зависимости от условий
выращивания и корма, а на абс, сух. в-во
раста. В наших опытах биомасса коловраток получена из проточной культуры, характеризующейся постоянной удельной скоростью роста (0,018 ч.1). Судя по количеству суммарных нуклеиновых кислот (6,9%), в популяции преобладали коловратки среднего возраста.
Аминокислотный состав биомассы коловраток имоин представлен в табл. 14. Суммарный аминокислотный состав коловраток и моин, питавшихся дрожками, был ниже, чем при питании хлореллой, соответственно на 12,82 и 15,18%.
Аминокислотный состав моин, питавшихся смешанными кормами А и Б, имел средние значения как по суммарному составу, так и по многим отдельным аминокислотам по сравнению с биомассой тих организмов, выращиваемых отдельно на дрожах или хлорелле. Вероятно, род дрожжей не влияет на аминокислотный состав биомассы моин.
В табл. 15 приведен аминокислотный состав белка моин и Іколовраток, выращенных на различных кормах, а также для сравнения использованных в опытах кормов и казенна — бел
на FiИВотного происхождения.
Все исследованные белки содержат полный набор незаменимых амінокислот.
Таблица 15 Аминокислотный состав белков различного происхождения, % на белок
* По Покровскому и др., 1972.
Отмечено, что белок Коловраток и моин накапливает ИШБ Отдельные аминокислоты в таком же количестве, как в корме. При кормлении коловраток хлореллой наблюдается сходство с кормом лишь по содержанию цистина и Изолейцина, а умоин — : по содержанию лизина и гистидина. В белке коловраток, потребЛЯВIII Их дрожжи, отмечена одинаковая с кормом концентрация пейцина и тирозина, а в белке моин — Тирозина и валина.
В белке моин, Питавшихся смешанным кормом (хлореллат
• дрожжи), отмечено равное количество лизина с белком дрож
жжей, а цистина, метионина, изолейцина и лейцина с белком . хлореллы. Вероятно, мойны выбирают из смешанного корма 2 главным образом хлореллу.
Отмечено более высокое содержание аргинина, аспарагиновой кислоты, глицина, аланина, цистина и более низкое — глютаминовой кислоты и пролина в белке коловраток и мои по сравнению с казеином, количество остальных аминокислот достаточно точно согласуется сказеином. В этом отношении белок " Водных беспозвоночных стоит ближе к животному белку - казеину, чем корма (хлорелла и дрожжи).
По сумме незаменимых аминокислот коловатки, накормленные хлореллой, и моины, итавшиеся смешанным кормом, имеют сходство с кормом. Потребление Коловратками только дроя; - жей имоинами только дрожжей либо хлореллы привело к снижению содержания аминокислот на 3-4% по сравнению скормом. В целом суммарное количество незаменимых аминокислог в биомассе моин иколовраток было ниже, чем в казеине и белке парамеций, на 2—7% в зависимости от корма. Вероятно. Это связано с достаточно однообразной пищей. Увеличение разнообразия корма, например за счет бактерий, приведет к возрастанию незаменимых аминокислот.
Данные по общему биохимическому составу парамеций, питавшихся дрозкажами и бактеріями, а также Коловраток и моин, накормленных хлорелой, оказывают, что количество белка в их биомассе составляет 57,47 — 59, 95 %. Белок исследованных водных беспозвоночных стоит ближе к животному белку — казеину и содерит полный набор незаменимых аминокислот дри высоком их значении (37—40%), что свидетельствует о его высокої пищевом качестве.
Для определения биологической ценности белка был использдван тест-организм Tetrahymena. Опыты проведены совместно с М. Ю. Соколович,
Биомассу водных беспозвоночных получали методом непропорционально-проточного культивирования. В качестве корма Для парамецийї служили прессованные дрозки, для моин — хлорелла, для дафний — хлорелла + гидролизные дрожжи.
Относительную биологическую ценность (ОБЦ) биомассы водных беспозвоночных определяли по методике, разработанной под руководством Н. Г. Беленького (1977). Тест-организмом служили Tetrahymena pyriformis W.
Питательная углеводно-солевая дрожжевая (УСД) среда содержала (г): глюкозы — 1,5, дрожжевого экстракта — 0,1, морской соли — 0,1. Дистиллированную воду (до 100 мл, рН 1,1) разливали по флакончикам по 1 мл, туда ке вносили испытуемый образец в виде сухого растертого порошка из расчета 0,07 мг азота на 1 мл УСД. Флакончики закрывали и автоклавировали при 1 атм в течение 30 мин. Каждый образец исследовали в трех повторностях, опыт повторяли 3 раза.
После охлаждения проводили посев по 0,02 мл 3-суточной культуры тетрахимен, выращенных при 25°С на пептонной среде (г): пептон — 2,0 , дрогатевой экстракт — 0,1, глюкоза — 0,5, хлористый натрий — 0,1, дистиллированная вода — до 100 мл (pH 7,1).
Инфузорий выращивали 4 сут при 25°С. Затем во флакончики вносили 3 мл фиксирующего раствора (20 мл 36 %-ного формалина, 175 мг КН,РО, 170 мг К,HPO4, 440 мл дистиллированной воды) и подсчитывали инфузорий в камере Фукса — Ро
Таблица 10 Относительная питательная ценность биомассы раздячных беспозвоночных
Примечание. Количество азота в Усд среде 0,07 мг/см?.
зенталя (в 10 квадратах). Для последующего расчета брали среднее количество инфузорий в одном квадрате.
Относительная биологическая ценность биомассы (ОБЦ) определяется отошением числа инфузорий, выросших на опытном образце, к числу инфузорий, выросших на контроле (экстракте казеина).
Результаты сведены в табл. 16. Относительная биологическая ценность биомассы (ОБЦ) парамеций составила 179,2%, а ветвистоусых рачков (моин и дафний) — 139,5—161,6%.
в целом опыты показали, что биомасса водных беспозвоночных (парамеций, мойн, дафний) имеет высокие кормовые и пищевые качества.
Таким образом, методы непрерывного культивирования открывают широкие возможности исследования водных беспозвоночных, а также определения их роли в экологических системах.
