НЕПРОПОРЦИОНАЛЬНО-ПРОТОЧНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КОЛОВРАТОК

Объектом служила Philodina acuticornis adiosa [Milne, 19161 из естественных мест обитания в районе г. Красноярска. Популяцию содержали в водопроводной воде в стеклянном цилиндрическом устройстве (200 см*), соргстеклянными пластинами внутри, что увеличивало площадь прикрепления коловраток (см. рис. 12). Культура освещалась зеркальной лампой 3H800 и вертикально расположенными лампами дневного света. Аэрацию осуществляли двумя эрлифтами (расход воздуха 1 л. мин/л культуры), что обеспечивало равномерное распределение корма. Свежую среду с кормом (питающая суспензия) подавали из резервуара, помещенного над реактором, где питающая суспензия африровалась, чтобы предотвратить оседание корма. Скорость подачи кормовой суспензии регулировали зажимом, излишки культуры выводились через отводную трубочку.

Применен метод непропорционально-проточного выращивания (кокова, Лисовский, 19766]. В наших экспериментах арфект непропорциональности достигался благодаря оседанию части коловраток на стенках и пластинках устройства. Коэффициент непропорциональности (к) рассчитывали по уравнению (14). Чис:10 Коловраток в культиваторе устанавливали

один раз в сутки, предварительно встряхивая его для равномерного распределения животных в среде. Количество их в Сливаемой части суспензии определяли при каждом сливе с помощью камеры Богорова. за суточную продуктивность (Y) популяции (в стационарный период) принимали отношение числа особей, выведенных из реактора, ко всему объему культуры в нем (см. уравнение 13).

Состояние популяции оценивали по показателям плотности, продуктивности и удельной скорости роста (р). Последнюю величину находили из уравнения для непрерывного процесса (6) с введением коэффициента непропорциональности (уравнение 16).

Кормом коловраткам служила Chlorella vulgaris.

Для того чтобы подобрать оптимальную концентрацию корма для непрерывного выращивания, нами проведен опыт с массовой периодической культурой Коловраток с теми же концентрациями хлореллы, что и в индивидуальной культуре, —0,1—1,6 т/л. Коловраток содеркали в аппаратах объемом 0,2 л с двумя эрлифтами и пластинами внутри (см. рис. 12). Культура круглосуточно аорировалась и освещалась, корм находился во взвешенном состоянии. Концентрацию корма корректировали круглосуточно через 2 ч.

Самая высокая плотность популяции (70 тыс. экз./см*) оказалась в опыте сконцентрацией хлореллы 0,40 г/л, однако в пределах 20-80 млн. кл./см3, или 0,2—0,8 г сух, в-ва/л, она оставалась высокой, и процесс был устойчивым (рис. 32).

Полученные в периодической культуре данные по конце?трации корма использованы нами при разработке метода интенсивного непропорционально-проточного культивирования.

Исходную суспензию хлореллы готовили в концентрации 10 млрд. кл./см2. Концентрация корма в питающей суспензии 30—40 млн./см3. Расход количества исходной суспензии хлореллы для получения питающей суспензии рассчитывали по уравнению

сар

(17)

где ус — объем исходной суспензии, который необходимо вноти в цитающую суспензию, соз; S — заданная концентрация хлореллы в итающей суспензии, млн. кл./см2; Ѕ, — концентрация исходной суспензии, млн. кл./см2; V, — объем питаю

ще й суспензии, см.

Всего выполнено три серии опытов. Первая состояла из двух опытов. Опыт 1 (рис. 33, а) проведен в химическом стакане, объем культуры 200 см3. Е?есуточно 0,25 его сливали и доливали свежую среду, концентрацию корма корректировали. Расход количества исходной суспензии для коррекции кон

центрации корма рассчитывали по уравнению

у (S — Sh).v+Vs

(18)

s,

где ѕk — фактическая концентрация корма перед коррекцией, млн. кл./см3; V — объем слива, см3.

 

В опыте 2 (см. рис. 33, б) популяцию содержали в установке сэрлифтами, где в отличие от химического стакана она аарировалась. Среда заменялась в дневное время непрерывно по каплям в течение 9 ч, т. е. по методу пол унепрерывного непропорционально-проточного культивирования. Скорость протока 5 об./сут.

Вторая серия (рис. 34) включала три опыта с различной температурой: 8 (опыт 3), 15 (опыт 4) и 23 — 27°C (опыт 5). Исходная плотность культуры 3000 экз./см*. Применен метод непрерывного непропорциональнопроточного выращивания. Скорость протока 10 об./сут.

Контрольные сливы проводили ежесуточно (по 0,25 объема культуры в культиваторе) с предварительным встряхиванием. Концентрация корма в питающей суспензии 40 млн. кл./см3.

В третьей серии (опыт 6) Контрольные сливы были также ежесуточными, но сливали по 0,5 объема культуры. Остальные условия те же, что и в опыте 5. В стационарный период в опыте 1 (см. рис. 33, а) плотность популяции равнялась 2500 экз./см* при ежесуточной продуктивности 600 экз./см3, или 120 мг сух, в-ва/л (сухой вес 1 экз. Ph. acuticornis odiosa был 0,18—0,2 мкг). Содержание влаги в биомассе коловраток — 90 % [Богатова и др., 1971]. Если допустить, что в биомассе Рh. acuticorns odiosa количество влаги такое же, то ее продуктивность в сыром весе составит 1,2 г/л- сут).

в опыте 2 (см. рис. 33, б) плотность культуры — 18 000 экз./см, что в 1,5 раза выше полученной в химическом стакане, а продуктивность - 6000 экз./см2, или 12 г/л- сут), -— в 10 раз выше по сравнению с опытом 1. Объясняется это различными условиями. В химическом стакане без аэрации часть внесенного корма через определенное время оседала на дно и была недоступна коловраткам. Увеличение скорости протока здесь, вероятно, привело бы к вымыванию культуры. В аппарате с эрлифтами постепенная смена среды (по каплям) позволяет сохранять ее относительно постоянной. При этом корм поддерживается во взвешенном состоянии за счет круглосуточной работы эрлифтов, и большинство коловраток, прикрепившись к стенкам сосуда и пластинам, спокойно потребляет его.

В опытах по выяснению влияния температуры на плотность и продуктивность непрерывной непропорционально-проточной культуры Коловраток получены следующие результаты. Спервых суток опыта при 8°С культура вымывалась (см. рис. 34). На 10-е сутки ее плотность составила лишь 15 экз./см3. При 15°C плотность в стационарный период равнялась 5000 экз./см. ежесуточная продуктивность — 1500 экз./см3 (при коэффициенте непропорциональности 33,3), удельная скорость роста — 0,012 ч-, время удвоения биомассы - 57,5 ч.

При комнатной температуре максимальная плотность доститла 20 000 экз./см, средняя в стационарный период — 14 000 экз./см, а сесуточная продуктивность — 4000 экз./см3 (коэффициент непропорциональности 35). Удельная скорость роста культуры в этом случае равнялась 0,011 ч-, время удвоения биомассы — 62,7 ч. в контрольных опытах (20 и 30°C) плотность и продуктивность популяции ниже, чем при 23—27°С.

Таким образом, оптимальная температура для непрерывной непропорционально-проточной культуры Коловраток находится в пределах 23—27°С. В этих условиях обеспечивается продуктивность 4000 экз./см3, или 0,8 г сух. в-ва/{а• сут) при плотности 14 000 экз./см3.

В опыте в коэффициент непропорциональности снижен по сравнению с опытом 5 до 17,8 за счет увеличения в 2 раза объема контрольных сливов (0,5 об./сут). В этом опыте плотность культуры составила 16 (0 акз./см3, но продуктивность была выше, чем в опыте 5, и достигала 9000 экз./см2, или 1,8 г сух. в-ва/ (л• сут). Удельная скорость роста популяции возросла до 0,023 ч-, а время удвоения биомассы сократилось до 30 ч.

В опытах 5и в определяли КПД биосинтеза культуры (превращение вещества корма в вещество Коловраток) по уравнению (Кокова, Лисовский, 1976)

?. • 100 КПД ---

(19) (s – S, p” где ?і — ежесуточный урожай коловраток, г сух. в-ва; s— Концентрация хлорены в сливе, мл, кл./см3; p — сухой вес 1 млн. клеток хлореллы, г.

При комнатной температуре КПІД биосинтеза непрерывной непропорционально-проточной культуры Коловраток составил 30—40%. Расход корма на дочернюю особь в этих условиях рассчитывали по уравнению

 

где ѕg — число клеток хлореллы на дочернюю особь, тыс.; е — ежее уточныії урожай коловраток, млн. экз. В наших опытах расход хлореллы на одну дочернюю особь при комнатной температуре 50 тыс. клеток.

Итак, разработанный нами для простейших метод непрерывчого непропорционально-проточного культивирования может oыть успешно применен при аналогичных работах с многоклеточными беспозвоночными (Rh. acuticornis).

Данный метод обеспечил плотность коловраток 16000 18 000 экз./см и ежесуточную продуктивность 9 тыс. экз./см3 что составляет 1,8 г сух. в-ва (л•Сут), или 18 г сыр. в-ва/л.

Влияние различных кормов на рост непропорциональнопроточной культуры ?оловраток. Кормом дІя коловраток слу, жат водоросли [Эрман, 1962; Овинникова, Глазачева, 1972. Корниенко, 1973; Спекторова и др., 1973), дрожжи [Фукусе и др., 1976) и т. д.

в задачу нашего исследования входило выявить влияние различных кормов на плотность, продуктивность и удельную скорость роста непрерывной непропорционально-проточной культуры Коловраток.

Коловраток содержали в аппарате объемом 0,2 л с двумя эрлифтами и пластинами внутри.

в опыте 1 в качестве корма использовали прессованные дрожки Saccharomyces cerevisiae сконцентрацией в питающей суспензии 40 млн. кл./см3. Среда - водопроводная вода, скорость протока 5 об./сут. Контрольные сливы проводили через 48 ч по 0,5 объема культуры в реакторе. В опытах 2 и 3 скорость протока 10 об./сут, среда — водопроводная вода, контрольные сливы осуществляли ежесуточно по 0,5 объема культуры в реакторе.

В опыте 2 в качестве корма брали смесь дрожжей Saccharomyces ellipsoides и бактерий Bacillus subtilis. Концентрация дрожжей в питающей суспензии составила 40 млн. кл./см3, а бактерий в 10 раз меньше (по сухому весу). В опыте 3 кормом служила хлорелла сконцентрацией в питающей суспензии 40 млн. кл./см3. В опыте 1 при коэффициенте непропорциональНости 14,9 средняя плотность культуры равнялась 5,77 тыс. экз./см (рис. 35), а ежесуточная продуктивность 1,6 тыс. экз./см2, или 3,2 r (л• сут), а = 0,014 ч-, время удвоения биомассы 49,3 ч.

В опыте 2, где в качестве корма использовали дрожки и бактерии, при коэффициенте непропорциональности 19,0 плотность популяции составила 10 тыс. экз./см при ежесуточной продуктивности 5,3 экз./см*, или 10,6 г/л, p = 0,02 ч-, время удвоения биомассы 34 ч.

В опыте 3 при коэффициенте непропорциональности 17,8 плотность коловраток была 16,0 тыс. экз./см3 при ежесуточной продуктивности 9 тыс. экз./см3, или 18 г сыр. в-ва/л, p=0,023 ч-, время удвоения биомассы 30 ч. 

Таким образом, различные корма (хлорелла, дрожжи, бактерии) обеспечили непрерывный рост культуры и ежеуточные урожаи от 3,2 до 18 г/л. Лучшие результаты получены при кормлении коловраток хлореллой.

Влияние различной скорости протока среды на рост непропорционально-проточной культуры коловраток. Одно из важных условий интенсивного непрерывного культивирования различных организмов — выведение продуктов метаболиза и обновление среды с определенной скоростью. Нами установлено влияние скорости протока среды на плотность, продуктивность и культуры коловраток. Коловраток выращивали в аппарате в объемом 0,2 л, Средой служила водопроводная вода, температура 27°C. в контроле популяцию содержали без протока.

В первой серии проведено три опыта, корм — хлорелла. В опыте 1 скорость протока среды 2 об./сут, во втором — 5, в третьом - 10 об./сут.

Во второй серии опытов в отличие от первой использован смешанный корм (хлорелла + дрожки) в соотношении 2: 1. В опытах 1—3 этой серии кормовую суспензию готовили ежесуточно в разных объемах среды с учетом скорости протока, но количество содержащегося в ней корма было одинаковым -— Дт сухого вещества хлореллы и 0,45 г прессованных дрожжей.

Кормовая суспензия подавалась по каплям в течение суток, 1 скорость протока – 2; 10 и 20 об./сут.

В контроле с первых суток плотность культуры возрастает, , а удельная скорость роста снижается, а затем становится отрицательной (рис. 36).

Результаты первой серии опытов показаны на рис. 37 и в табл. 4. С увеличением протока среды до 5 об./сут плотность популяции возрастает с повышением коэффициента непропорциональности (см. табл. 4). Усиление протока среды привело к снижению коэффициента непропорциональности и плотности культуры при возрастании продуктивности и р (см. рис. 37).

 

Результаты второй серии опытов сведены в табл. 4 и рис. 38. Обобщенная зависимость плотности, продуктивности и и культуры показана на рис. 39. Сувеличением скорости протока до 10 об./сут плотность популяции возрастает до 16 тыс. экз./см3, однако при высоком коэффициенте непропорциональности (28,9) продуктивность составляет 5,5 тыс. экз./см3. Дальнейшее повышение скорости протока снижает коэффициент непропорциональности и плотность культуры при все возрастающей продуктивности и р.

Опыты второй серии показали, что при равной скорости протока сметанный корм (хлорелла +дрозкжи) обеспечивает продуктивность коловраток почти в 2 раза ниже, чем при кормлении одной хлореллой равной концентрации.

Следовательно, оптимум скорости протока для Ph. acuticornis adiosa находится в пределах 5—20 об./сут и тесно связан с комофициентом непропорциональности.

Разработка реактора для массового непропорциональнопроточного культивирования Коловраток. Исследования по

влиянию корма, температуры, скорости протока дозволили подобрать оптимальные условия для непропорционально-проточного выращивания Ph. acuticornis odiosa и получить высокую ежесуточную продуктивность коловраток — от 18 до 25,8 г/л, или около 20 г/л. Работы выполнены в реакторе объемом 0,2 л, ежесуточная производительность которого составила 4 г сырой биомассы.

С целью получения для научных и практических целей больших количеств биомассы коловраток на ми разработан реактор увеличенного (7 л) объема (рис. 40 и 41).

Основная часть культиватора – реактор (см. рис. 40, а), который изготовлен из оргстекла и имеет форму параллелепипеда (8х24х50 см) с зауженным дном. Аэрация осуществлялась с помощью 44 эрлифтов (см. рис. 40, в) диаметром 8 мм. Воздух от компрессоров (1,4 л/мин на 1 л культуры) подавался в ресивер (см. рис. 40, г), диаметр которого был больше, чем у эрлифтов, — 30 мм. Это позволило создать определенное давление воздуха в системе, что обеспечило равномерность его подати в эрлифты. Излишки культуры выводились через отводную трубочку по уровню (см. рис. 40, б). В 1,5 м над установкой подвешивалась лампа Зн, которая давала освещенность на поверхности культуры 1500 лв. с одной стороны реактора освещенность была 1500 лк, с противоположной - 200 лк. Питающая суспензия (вода + хлорелла) подавалась по каплям со скоростью протока 2,15 об./сут. Концентрация хлорелл тающей суспензии 30— 60 млн. кл./см. Два раза в сутки водили коррекцию концентрации хлореллы в культуре ло 40 млн. кл./см. Контрольные сливы с предварительным помешиванием осуществляли ежесуточно по 0,15 объема. Исходная плотность культуры 40 экз./см“, средняя плотность за последние 20 сут опыта (длительность опыта 38 сут) 10 тыс. экз./см3, а максимальная достигла 34 тыс. экз. см. При коэффициент пропорциональности 1,5 средний ежесуточный урожай составил 6,5 тыс. экз./см3 культуры в реакторе, или 13 г сыр. в-вал.

Таким образом, метод непропорционально-проточного выращивания коловраток в культиваторе, увеличенном в 35 раз по сравнению с ранее используемым, при скорости протока 2 об./сут обеспечил устойчивый рост популяции и ежесуточную продукцию 90 г сыр. в-ва/л.

Если весь урожай использовать для личинок карда или растительноядных рыб по нормам Г. С. Корниенко (1971) или Л. А. Корнеевой с соавторами (1972), то можно прокормить ежесуточно около 100 тыс. личинок в первые сутки постэмбрионального развития.

в культиваторе объемом Tл из-за неравномерного освещения часть коловраток образовывала зимние яйца. Для равномерного распределения света на ми разработан специальный культиватор (рис. 42) для непропорционально-проточного выращивания коловраток. Реактор объемом 10 л имеет цилиндрическую форму. Полый внутренний цилиндр 8 изготовлен из оргстекла, культура освещается люминесцентной лампой ЛДЦ-20(6), вставленной внутрь прозрачного цилиндра, что обеспечивает более равномерное, чем в предыдущей конструкции, распределение света. Для того чтобы лампа не соприкасалась со стенками прозрачного цилиндра, ее верхний конец помещен в отверстие решетчатой крышки, а нижний закреплен во фланце 7.

Наружная двустенная часть корпуса 3 изготовлена из нержавеющей стали, одновременно она служит термостабилизирующей рубашкой. Через отводные трубки культура поступает в эрлифты 2, воздух в них круглосуточно подается через ресивер 1 со скоростью 1 л/мин на 1 л культуры. С помощью эрлифтов перемешивается корм и популяция обогащается кислородом. Средой служит отстоянная водопроводная вода. Питающая суспензия (вода -- хлорелла в концентрации -- 100 млн. кл./см в стационарный период) подается в культиватор со скоростью 2 об./сут, излишки по уровню сливаются через трубку 10.

В опытах применен метод непропорционально-проточного культивирования коловраток, при котором часть коловраток оседает на стенках реактора и радиально расположенных пластинах 5. Раз в сутки культуру перемешивали с помощью воздуха, подаваемого в реактор через стеклянную трубочку, и определяли ее плотность контрольным сливом через трубку 11 до 0,1 — 0,2 объема. Концентрацию корма в реакторе поддеркивали на уровне 40 млн. кл./ см. Общий вид установки показан на рис. 43.

В стационарный период плотность коловраток составила 9 тыс. экз./см", а ежесуточная продукция с культиватора 200 г сырой биомассы. Предлагаемый вариант установки может быть увеличен до 60 л (см. рис. 43) и применен для непропорционально-проточного выращивания различных видов коловраток, а также простейших и использоваться для научных и практических целей (выращивание живых кормов для личинок рыб, очистка сточных вод и т. д.).

Таким образом, интенсивное изучение биологии кои ловраток и совершенствование метода периодического культивирования позволило получить продуктивность Планктонных коловраток Br. plicatilis 1 Br. calyciflorus около 200 г/(м*. сут) (Овинникова, 1970; Фукусе и др., 1976; Галковская и 1979).

др., Т. Мотидзуки с соавторами (1978) на основе метода непрерывного выращивания получили продуктивность Br. calyciflorus 1—2 кг/ (м3 - сут) (по нашим расчетам), что в 10 раз больше, чем в периодической культуре.

Разработанные на ми метод и техника непропорционально-проточного культивирования PR. acuticornis odiosa обеспечили ее продуктивность около 20 г/(л•Сут), что в десятки раз превышает данные, полученные в периодической и непрерывной культуре планктонных коловраток.